Kvantifisering agonistaktivitet på G protein-koblede reseptorer
Summary
En metode for estimering av affinitet konstant av en agonist for den aktive stat (<em> K<sub> B</sub</em>) Av en G protein-koblet reseptor er beskrevet. Analysen gir absolutt eller relativ tiltak av<em> K<sub> B</sub</em> Avhengig av om konstituerende receptor aktivering er målbar. Vår metode gjelder ulike reaksjoner nedstrøms fra receptor aktivering.
Abstract
Når en agonist aktiverer en populasjon av G protein-koblede reseptorer (GPCRs), utløser det et signalveien som kulminerer i respons i cellen eller vevet. Denne prosessen kan analyseres på nivå med en enkelt reseptor, en befolkning på reseptorer, eller nedstrøms respons. Her vil vi beskrive hvordan å analysere nedstrøms respons å få et estimat av agonist affinitet konstant for den aktive staten singel reseptorer.
Reseptorer oppfører seg som quantal brytere som veksler mellom aktive og inaktive stater (Figur 1). Den aktive stat samhandler med spesifikke G proteiner eller annen signalering partnere. I fravær av ligander, dominerer de inaktive tilstand. Bindingen av agonist øker sannsynligheten for at reseptoren vil gå over til aktiv tilstand fordi dets affinitet konstant for den aktive stat (K b) er mye større enn for de inaktive tilstand (K a). Den summering avtilfeldige utganger av alle reseptorer i befolkningen gir et konstant nivå av reseptor aktivering i tid. Den gjensidige av konsentrasjonen av agonist fremlokkende halv maksimal receptor aktivering tilsvarer den observerte affinitet konstant (K obs), og brøkdel av agonist-reseptor komplekser i aktiv tilstand er definert som effekt (ε) (figur 2).
Metoder for å analysere nedstrøms reaksjoner GPCRs har blitt utviklet som muliggjør estimering av K obs og relative effekten av en agonist 1,2. I denne rapporten viser vi hvordan du kan endre denne analysen å estimere agonist K b verdi i forhold til kvarandre agonist. For analyser som viser konstitutive aktivitet, viser vi hvordan man skal beregne K b i absolutte enheter av M -1.
Vår metode for å analysere agonist konsentrasjon-respons kurver 3,4 bestårav global lineære regresjon ved hjelp av driftsmodell 5. Vi beskriver en prosedyre med program, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analysen gir et estimat av produktet av K obs og en parameter proporsjonal effekt (τ). Estimatet på τK obs på en agonist, dividert med at en annen, er et relativt mål på K b (RA i) seks. For noen reseptor viser konstitutive aktivitet, er det mulig å estimere en parameter proporsjonal med effekten av gratis reseptor kompleks (τ sys). I dette tilfellet er K b verdien av en agonist tilsvarer τK obs / τ sys 3.
Vår metode er nyttig for å bestemme selektiviteten av en agonist for reseptorsubtyper og for å kvantifisere agonist-reseptor-signalering gjennom ulike G proteiner.
Protocol
Discussion
Fordi vår metode for å anslå RA i (relativ K b verdi) bare krever måling av agonist konsentrasjon-respons kurver, kan vår analyse gjøres når som helst disse kurvene er målt.
Hvis dag-til-dag variasjon i responsen av den eksperimentelle forberedelser (f.eks, celler eller vev) er stor, kan responsen målinger av hver konsentrasjon-respons-kurven være normalisert i forhold til "Top" estimat av standarden agonist for hver dag eksperiment…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant GM 69829.
Referências
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. . Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T., Enna, S. J. . Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
