Kvantifiera agonist vid G-protein-kopplade receptorer
Summary
En metod för att uppskatta affinitetskonstant av en agonist för den aktiva staten (<em> K<sub> B</sub</em>) I ett G-protein-kopplade receptorer beskrivs. Analysen ger absolut eller relativt mått på<em> K<sub> B</sub</em> Beroende på om konstitutiv aktivering av receptorn är mätbara. Vår metod gäller olika svar nedströms aktivering av receptorn.
Abstract
När en agonist aktiverar en population av G-protein-kopplade receptorer (GPCRs), framkallar det en signalväg som kulminerar i ett svar från de celler eller vävnader. Denna process kan analyseras på samma nivå som en enda receptor, en befolkning av receptorer, eller nedströms svar. Här beskriver vi hur man kan analysera nedströms svar för att få en uppskattning av agonist affinitet konstant för det aktiva tillståndet av enstaka receptorer.
Receptorer beter sig som quantal växlar som växlar mellan aktiva och inaktiva stater (Figur 1). Den aktiva staten interagerar med specifika G-proteiner eller andra signalsystem partner. I avsaknad av ligander, dominerar inaktiva tillstånd. Bindningen av agonist ökar sannolikheten för att receptorn växlar till aktivt läge eftersom dess affinitet konstant för det aktiva tillståndet (K b) är mycket större än för den inaktiva staten (K a). Den summering avslumpmässiga utgångar av alla de receptorer i befolkningen ger en konstant nivå av aktivering av receptorn i tid. Den ömsesidiga av koncentrationen av agonist utlösande halv-maximal aktivering av receptorn motsvarar den observerade affinitet konstant (K OBS), och andelen agonist-receptor komplex i den aktiva staten definieras som effekt (ε) (Figur 2).
Metoder för att analysera nedströms svar GPCRs har utvecklats som gör det möjligt för uppskattning av K-obs och relativa effekten av en agonist 1,2. I denna rapport visar vi hur du ändrar denna analys för att uppskatta agonist k B värde i förhållande till en annan agonist. För analyser som uppvisar konstituerande aktivitet visar vi hur man kan beräkna k B i absoluta enheter av M -1.
Vår metod för att analysera agonist koncentration-respons-kurvor 3,4 bestårav de globala icke-linjär regression med verksamhetsmodellen 5. Vi beskriver ett förfarande med hjälp av programmet, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Analysen ger en uppskattning av produkten av K-obs och en parameter proportionell effekt (τ). Uppskattningen av τK obs av en agonist, delat med en annan, är ett relativt mått på K b (RA i) 6. För alla receptorn uppvisar konstitutiv aktivitet är det möjligt att skatta en parameter i proportion till effekten av den fria receptor komplex (τ sys). I det här fallet är K b värdet av en agonist motsvarande τK obs / τ SYS 3.
Vår metod är användbar för att bestämma selektiviteten hos en agonist för receptor subtyper och för att kvantifiera agonist-receptor signalering genom olika G-proteiner.
Protocol
Discussion
Eftersom vår metod för att uppskatta RA i (relativ K B-värdet) kräver endast mätning av agonist koncentration-respons-kurvor, kan vår analys göras när som helst dessa kurvor mäts.
Om dag till dag variation i svaret från den experimentella preparat (t.ex. celler eller vävnader) är stor, kan svaret mätningar av koncentration-respons-kurvan normaliseras i förhållande till "toppen" uppskattning av standard-agonist för varje dag ex…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en National Institutes of Health Grant GM 69.829.
Referências
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. . Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T., Enna, S. J. . Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
