Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Summary

Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.

Abstract

Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. ¹ De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. ¹ Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, ² en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. ³ In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. ³ Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. ⁴ Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. ⁵ Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. ⁶ Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). ⁷ Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) ⁸ of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). ⁹ Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 ^– CD45RA ^– effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test ^7.

Protocol

1. Isolatie van PBMC Draw bloed (7.5-8.0 ml) in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met Sodium Heparine. De buis bevat een natrium-heparine en een Ficoll-Hypaque dichtheid vloeistof, plus een polyester gel barrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugebuis / bloed bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) in een horizontale rotor (swing-out head) gedurende 20 min bij 1800 x g. Schakel centrifuge remmen uit. Na het centrifugeren, de volgorde van lagen gebeurt als volgt (van bove…

Discussion

De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische …

Materials

Reagent name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronate
PROLEUKIN	Novartis Pharmaceuticals		human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203- medium	Cell Science & Technology Institute	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
brefeldin A	Sigma	B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P1585-1MG
ionomycin	Sigma	13909-1ML
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-human CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-human CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-human CD19-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-human CD45-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-human CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-human TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-human CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-human CD69-PE	BD	555531
anti-human NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	BECKMAN COULTER	IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE	BECKMAN COULTER	A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798