Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato
Summary
Um método para expandir células T γδ a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é descrito. PBMC células derivadas de T γδ são estimuladas e expandida usando zoledronato e interleucina-2 (IL-2). Expansão em grande escala de células T γδ podem ser aplicadas a imunoterapia celular autóloga de câncer.
Abstract
Células T γδ podem reconhecer e responder a uma grande variedade de estresse induzido por antígenos, desenvolvendo assim uma atividade ampla inata anti-tumorais e anti-infecciosos. 1 A maioria das células T γδ no sangue periférico tem o Vγ9Vδ2 receptor de células T. Estas células reconhecem o antígeno em um principal de histocompatibilidade forma complexa independente e desenvolver forte citolítica e Th1-like funções efetoras. 1 Portanto, as células T γδ são células efetoras candidato atraente para a imunoterapia do câncer. Vγ9Vδ2 células T responder a phosphoantigens tais como (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enilo pirofosfato (HMBPP), que é sintetizada em bactérias através de biossíntese de isoprenóides; 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), que é produzido em células eucarióticas através da via mevalonato. 3 Na condição fisiológica, a geração de IPP na célula nontransformed não é suficiente para a ativação de células T γδ. Desregulação da via mevalonato em células tumorais leva ao acúmulo de IPP e γδ T ativação das células. 3 Porque aminobisphosphonates (tais como o pamidronato ou zoledronato) inibem sintase farnesil pirofosfato (FPP), a enzima agir a jusante do IPP na via mevalonato, níveis intracelulares de IPP e sensitibity para γδ reconhecimento células T pode ser terapeuticamente aumentou aminobisphosphonates. IPP acumulação é menos eficiente nas células nontransfomred de células tumorais com uma concentração farmacologicamente relevantes da aminobisphosphonates, que nos permitem imunoterapia para o câncer, ativando as células T γδ com aminobisphosphonates. 4 Curiosamente, IPP acumula em monócitos quando PBMC são tratados com aminobisphosphonates, por causa do eficiente absorção de drogas por essas células. 5 monócitos que se acumulam IPP se tornar células apresentadoras de antígenos e estimular Vγ9Vδ2 células T no sangue periférico. 6 Com base nesses mecanismos, nós desenvolvemos uma técnica de expansão em grande escala de culturas de células T γδ usando zoledronato e interleucina -2 (IL-2). 7 Outros métodos para a expansão de células T γδ utilizar o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) 8 ou 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP). 9 Todos estes métodos permitem que ex vivo de expansão, resultando em um grande número de células T γδ para uso em imunoterapia adotiva. No entanto, apenas zoledronato é um reagente FDA-approved disponíveis comercialmente. Zoledronato-expandida de células T γδ mostrar CD27 – CD45RA – fenótipo de memória efetoras e sua função pode ser avaliada por IFN-γ ensaio de produção 7.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado permite a expansão eficiente de células T γδ do PBMC. células γδ T ativadas e se expandiu por zoledronato e IL-2 completa desenvolver funções efetoras, refletido pela produção de citocinas e citotoxicidade. Tem sido relatado que o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) também expandir as células T γδ, no entanto, eles não estão disponíveis comercialmente. Em contraste, zoledronato já está licenciado para aplic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| ZOMETA | Novartis Pharma K. K | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma | 13909-1ML | |
| IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 |
|
| anti-human CD4-ECD | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |
Referências
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