Utbyggnad av Human Peripheral Blood γδ T-celler med hjälp zoledronate
Summary
En metod att expandera γδ T-celler från perifera mononukleära blodceller (PBMC) beskrivs. PBMC-derived γδ T-celler stimuleras och byggas ut med zoledronate och interleukin-2 (IL-2). Storskalig utbyggnad av γδ T-celler kan användas för autolog cellulär immunterapi av cancer.
Abstract
Mänskliga γδ T-celler kan känna igen och reagera på ett brett utbud av stress-inducerade antigener, och därmed utveckla medfödda bred anti-tumör och anti-infektiösa aktivitet. 1 Majoriteten av γδ T-celler i perifert blod har Vγ9Vδ2 T cell receptorn. Dessa celler känner igen antigen i ett större histocompatibility komplex-oberoende sätt och utveckla starka cytolytisk och Th1-liknande effektorfunktioner. 1 Därför γδ T-cellerna är attraktiv kandidat effektorceller celler för immunterapi. Vγ9Vδ2 T-celler svarar på phosphoantigens t.ex. (E)-4-hydroxi-3-metyl-men-2-enyl pyrofosfat (HMBPP), som bildas i bakterier via isoprenoid biosyntes, 2 och isopentenyl pyrofosfat (IPP), som produceras i eukaryota celler genom mevalonat vägen. 3 i fysiologiska tillstånd är generering av IPP i nontransformed cellen inte tillräckligt för aktivering av γδ T-celler. Dysreglering av mevalonat vägen i tumörceller leder till ansamling av IPP och γδ T celler aktiveras. 3 Eftersom aminobisphosphonates (såsom pamidronat eller zoledronate) hämmar farnesylpyrofosfatsyntas (FPP), det enzym som agerar nedströms IPP i mevalonat väg, intracellulära nivåer av IPP och sensitibity att γδ T-celler erkännande kan vara terapeutiskt ökas med aminobisphosphonates. IPP ackumulering är mindre effektiv i nontransfomred celler än tumörceller med en farmakologiskt relevant koncentration av aminobisphosphonates, som tillåter oss immunterapi för cancer genom att aktivera γδ T-celler med aminobisphosphonates. 4 Intressant ackumuleras IPP i monocyter när PBMC behandlas med aminobisphosphonates, på grund av effektiva drog upptag av dessa celler. 5 Monocyter att IPP ackumuleras blir antigen-presenterande celler och stimulera Vγ9Vδ2 T-celler i perifert blod. 6 Baserat på dessa mekanismer, utvecklade vi en teknik för storskalig expansion av γδ T cellkulturer med zoledronate och interleukin -2 (IL-2). 7 Andra metoder för expansion av γδ T-celler utnyttja syntetiska phosphoantigens bromohydrin pyrofosfat (BrHPP) 8 eller 2-metyl-3-butenyl-1-pyrofosfat (2M3B1PP). 9 Alla dessa metoder gör ex vivo expansion, vilket resulterar i ett stort antal γδ T-celler för användning i adoptiv immunterapi. Det är dock endast zoledronate ett FDA-godkända kommersiellt tillgängliga reagens. Zoledronate-expanderade γδ T-celler visa CD27 – CD45RA – effektor minne fenotyp och dess funktion kan utvärderas av IFN-γ produktion analys 7.
Protocol
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör en effektiv expansion av γδ T-celler från PBMC. γδ T-celler aktiveras och utökas med zoledronate och IL-2 utveckla kompletta effektorfunktioner, reflekteras av cytokin produktion och cytotoxicitet. Det har rapporterats att den syntetiska phosphoantigens bromohydrin pyrofosfat (BrHPP) och 2-metyl-3-butenyl-1-pyrofosfat (2M3B1PP) också utöka γδ T-celler, men de är inte kommersiellt tillgängliga. Däremot är zoledronate redan licensierad för kliniska tillämpningar s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| ZOMETA | Novartis Pharma K. K | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma | 13909-1ML | |
| IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 |
|
| anti-human CD4-ECD | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |
Referências
- Bonneville, M., O’Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
