Summary

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Published: October 24, 2011
doi:

Summary

공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

Abstract

진핵세포 리보솜 따라서 연구자에게 상당한 도전을 초래할 훨씬 더 불안 정한 자신의 eubacterial 및 archael 대응에 비해 같습니다. 특히 성가신 세포의 용해는 프로 테아제와 리보솜을 저하시킬 수 nucleases 다수 출시는 사실입니다. 따라서, 가능한 빨리 이러한 효소의 변이를 분리하는 것이 중요합니다. 불행하게도, 기존의 차동 ultracentrifugation 방법은 그들의 구조적 무결성과 기능에 영향을 미치는 시간의 unacceptably 오랜 기간 동안 이러한 효소에 노출 변이를 떠납니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 Sulfolink 수지 부과 시스테인을 사용하여 색층 방법을 활용합니다. 이 간단하고 빠른 응용 프로그램이 크게 손상, 높은 화학적 활성 효모 변이의 높은 수율을 생산 공동 정화 proteolytic와 nucleolytic 활동을 줄여줍니다. 우리는이 방법은 또한 포유류의 변이에 적용되어야하는 것이 좋습니다. 의 단순화방법, 그리고 chromatographically 정화 ribosome의 향상된 순도와 활동은 진핵세포 리보솜의 연구를위한 중요한 기술적 진보를 나타냅니다.

Protocol

1. 시스테인의 준비 Sulfolink 수지 부과 상온에서 Sulfolink 수지 (피어스)를 준비합니다. 각 유리병에 배포 5 ML과 같은 2 인용 10 ML 플라스틱 튜브의 제조 업체에서 제공하는 Sulfolink 커플링 젤의 50 % 슬러리 10 ML 총 놓으십시오. 간단히 850 XG에 튜브를 원심 조심스럽게 supernatants를 제거합니다. 5 ML에 비즈를 resuspending XG 850에서 간략하게 centrifuging 및 피펫으로 뜨는을 제거하?…

Discussion

Ribosome 정화 프로토콜은 기본적으로 저속 회전에서 cytosolic 분수를 수확, lysing 세포를 포함하고 고속 원심 분리 1 변이를 pelleting. 몇 가지 새로운 방법이 박테리아 리보솜을 정화에 사용되고있는 반면, 동일 eukaryotes 2-4 사실이 아니했다. 추가 단계 년, 예를 들어 소금 세척 및 글리세롤 방석 (예 : 5 참조) 함께 추가되었습니다 있지만, 효모 변이의 생화 학적 및 구조 연구는 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 애쉬튼 Belew, 카렌, 잭 Sharmishtha Musalga, 세르게이 Sulima, Shivani Reddy, 그들의 도움이 프로젝트에 대한 입력을위한 마이클 Rhodin 포함 Dinman 연구소의 구성원 모두 감사하고 싶습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (AHA 0630163N)에서 오전과 국립 보건원 (5R01 GM058859 – 12)에서 JDD에 보조금에 의해 지원되었다. JAL은 부모 부여 2,009 보완의 미국의 재투자 및 복구 법 (3R01GM058859 – 11S1)에 의해 지원되었다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Sulfolink Coupling resin Pierce 20402
Mini bead-beater 16 Biospec 607
Optima Max E ultracentrifuge Beckman Coulter  
Legend RT Sorvall  
0.5 mm Glass beads Biospec 11079105
Tris Sigma-Aldrich 252859
EDTA Sigma-Aldrich E9884
DTT Sigma-Aldrich 43815
HEPES Sigma-Aldrich 54459
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
KCl Sigma-Aldrich 60128
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661
KOH Sigma-Aldrich 221473
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Puromycin Sigma-Aldrich P7255
GTP Fermentas R0461

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Citar este artigo
Meskauskas, A., Leshin, J. A., Dinman, J. D. Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes. J. Vis. Exp. (56), e3214, doi:10.3791/3214 (2011).

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