Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active
Summary
Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.
Abstract
Ribosomi eucariotici sono molto più labili rispetto alle loro controparti eubatteri e archael, ponendo così una sfida significativa per i ricercatori. Particolarmente fastidioso è il fatto che la lisi delle cellule rilascia un gran numero di proteasi e nucleasi che può degradare i ribosomi. Quindi, è importante separare i ribosomi di questi enzimi nel più breve tempo possibile. Purtroppo, i metodi convenzionali ultracentrifugazione differenziale lascia ribosomi esposti a questi enzimi per periodi troppo lunghi di tempo, che influiscono sulla loro integrità strutturale e la funzionalità. Per risolvere questo problema, utilizziamo un metodo cromatografico utilizzando una cisteina carica Sulfolink resina. Questa applicazione semplice e rapida riduce in modo significativo le attività di co-purificazione proteolitici e nucleolytic, producendo rendimenti elevati di intatto, ribosomi lieviti altamente biochimicamente attivi. Suggeriamo che questo metodo dovrebbe essere applicabile anche ai ribosomi dei mammiferi. La semplicità diil metodo, e la purezza maggiore e l'attività del ribosoma cromatograficamente purificato rappresenta un progresso tecnico significativo per lo studio dei ribosomi eucarioti.
Protocol
Discussion
Protocolli di purificazione ribosoma fondamentalmente coinvolgere le cellule di lisi, raccolta una frazione citosolica da un testacoda a bassa velocità, e poi cubettatura ribosomi tramite centrifugazione ad alta velocità 1. Mentre un paio di nuovi metodi sono stati utilizzati per purificare i ribosomi batterici, lo stesso non fosse stato vero per eucarioti 2-4. Anche se ulteriori passi sono stati aggiunti nel corso degli anni, si lava sale ad esempio, e cuscini glicerolo (ad esempio vedi 5),…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare tutti i membri del laboratorio Dinman, tra Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, e Michael Rhodin per il loro aiuto e l'ingresso su questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni a AM dalla American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD dal National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL è stata sostenuta da un reinvestimento americano e Recovery Act del 2009, supplemento alla concessione genitore (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
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