Förorening av beredningar av eukaryota ribosomer renas med traditionella metoder av samtidig renande nukleaser och proteaser en negativ inverkan på nedströms biokemiska och strukturella analyser. En snabb och enkel kromatografisk rening metoden används för att lösa detta problem med hjälp av jäst ribosomer som modellsystem.
Eukaryota ribosomer är mycket mer instabil jämfört med deras färgas eubakteriecellerna och archael motsvarigheter, vilket utgör en betydande utmaning för forskarna. Särskilt besvärande är det faktum att lys av celler släpper ett stort antal proteaser och nukleaser som kan försämra ribosomer. Därför är det viktigt att skilja ribosomer från dessa enzymer så snabbt som möjligt. Tyvärr lämnar konventionell differential ultracentrifugering metoder ribosomer utsatta för dessa enzymer för oacceptabelt lång tid, vilket påverkar deras strukturella integritet och funktionalitet. För att lösa detta problem använder vi en kromatografisk metod med en cystein laddat Sulfolink harts. Detta enkla och snabba användning minskar betydligt samtidigt renande proteolytiska och nucleolytic aktiviteter, producera hög avkastning av intakta, mycket biokemiskt aktiv jäst ribosomer. Vi föreslår att metoden också ska tillämpas på däggdjur ribosomer. Enkelheten imetoden och den förbättrade renhet och aktivitet kromatografiskt renat ribosomen utgör en betydande tekniska framsteg för studiet av eukaryota ribosomer.
Ribosomen rening protokoll innebär i grunden lyserings celler, skörda ett cytosoliskt fraktionen från en låg hastighet spinn och sedan pelletering ribosomer med hög hastighet centrifugering 1. Medan några nya metoder har använts för att rena bakteriella ribosomer, hade samma inte varit sant för eukaryoter 2-4. Trots att ytterligare steg har lagts till under åren, t ex tvättar salt och kuddar glycerol (se t.ex. 5), har biokemiska och strukturella studier av jäst ribosomer har …
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla medlemmar i Dinman laboratoriet, inklusive Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, och Michael Rhodin för deras hjälp och synpunkter på detta projekt. Detta arbete har finansierats med bidrag till AM från American Heart Association (AHA 0630163N) och JDD från National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL fick stöd av en amerikansk Reinvestment och Recovery Act av 2009 komplement till den förälder bidraget (3R01GM058859-11S1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
Legend RT | Sorvall | |
0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
GTP | Fermentas | R0461 |