Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer
Summary
Forurensning av preparater av eukaryote ribosomer renset ved tradisjonelle metoder ved co-rense nukleaser og proteaser påvirker negativt på nedstrøms biokjemiske og strukturelle analyser. En rask og enkel kromatografisk rensing metoden brukes til å løse dette problemet ved hjelp av gjær ribosomer som modell system.
Abstract
Eukaryote ribosomer er mye mer labil i forhold til deres eubacterial og archael kolleger, og dermed utgjør en betydelig utfordring for forskere. Spesielt problematisk er det faktum at lysis av celler utgivelser et stort antall av proteaser og nukleaser som kan redusere ribosomer. Derfor er det viktig å skille ribosomer fra disse enzymene så raskt som mulig. Dessverre forlater konvensjonelle differensial ultracentrifugation metoder ribosomer utsatt for disse enzymene for uakseptabelt lang tid, påvirker deres strukturelle integritet og funksjonalitet. For å løse dette problemet, benytter vi en kromatografisk metode ved hjelp av en cystein ladet Sulfolink harpiks. Denne enkle og raske søknad reduserer co-rensende proteolytiske og nucleolytic aktiviteter, produsere høy avkastning av intakte, svært biokjemisk aktiv gjær ribosomer. Vi foreslår at denne metoden også bør gjelde for pattedyr ribosomer. Enkelheten avmetoden, og den forbedrede renhet og aktivitet av kromatografisk renset ribosomet representerer en betydelig teknisk fremskritt for studier av eukaryote ribosomer.
Protocol
Discussion
Ribosom rensing protokoller i utgangspunktet involvere Lysing celler, høsting en cytosoliske brøkdel av en lav hastighet spinn, og deretter pelletering ribosomer ved høy hastighet sentrifugering 1. Mens noen nye metoder har blitt brukt for rensing av bakterielle ribosomer, hadde det samme vært tilfelle for eukaryoter 2-4. Selv om flere tiltak har blitt lagt langs årene, f.eks salt vasker, og glyserol puter (f.eks se 5), har biokjemiske og strukturelle studier av gjær ribosomer vær…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke alle medlemmene av Dinman laboratoriet, blant annet Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, og Michael Rhodin for deres hjelp og innspill på dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til AM fra American Heart Association (AHA 0630163N) og JDD fra National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL ble støttet av en amerikansk reinvestering og Recovery Act av 2009 supplement til den overordnede stipend (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Referências
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Bioquímica. 15, 2289-2296 (1976).
