הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

Summary

בדיקת האורך של איבוד מסת העצם של עצמות הירך לבין tibiae של עכברים בוגרים בוצעה בעקבות פגיעה בחוט השדרה באמצעות רציפים במינון נמוך רנטגן סורק. אובדן העצם Tibia זוהה לאורך כל תקופת המחקר, תוך איבוד מסת העצם בעצם הירך לא זוהה עד 40 ימים שלאחר הפציעה.

Abstract

פגיעה בחוט השדרה (SCI) מלווה לעתים קרובות באזורים sublesional של האגן ואת הגפיים התחתונות על ידי אוסטאופורוזיס, המוביל תדירות גבוהה יותר של שברים ^1. כמו שברים אלה לעיתים קרובות מופיעות באזורים שאיבדו את התפקוד החושי הרגיל, החולה נמצא בסיכון גדול יותר של פתולוגיות שבר תלויי, כולל מוות. SCI תלויי אובדן צפיפות העצם הן (BMD, גרם / ס"מ ²⁾ ו המינרלים בעצמות תוכן (BMC, גרם) יוחסה חוסר שימוש מכני ^{2, 3} סוטה איתות עצבי ושינויים הורמונליים ^4. השימוש במודלים של מכרסמים אוסטאופורוזיס SCI-Induced יכולים לספק מידע רב ערך לגבי המנגנונים שבבסיס התפתחות אוסטאופורוזיס הבאים SCI כמו גם סביבת בדיקה עבור הדור של טיפולים חדשים ^5-7 (ו הנסקרת ב ^8). מודלים עכבר של SCI הם עניין רב כפי שהם היתר הגישה הרדוקציוניסטית אל ba-מנגנוןsed הערכה באמצעות העכברים הטרנסגניים בטלה. בעוד מודלים כגון סיפקו נתונים חשובים, עדיין יש צורך, שיטות מינימלית פולשנית ואמינה, לשחזור, וכמותיים בקביעת מידת איבוד מסת העצם הבא SCI, במיוחד לאורך זמן בתוך קבוצה זהה של חיות הניסוי, כדי לשפר את האבחון , שיטות טיפול, ו / או מניעת אוסטאופורוזיס SCI-Induced.

שיטה אידיאלי למדידת צפיפות העצם אצל מכרסמים תאפשר חשיפות מרובות, רציפים (לאורך זמן) אל רמות נמוכות של קרינת רנטגן. מחקר זה מתאר את השימוש בסורק שלמה חיה חדשה, IVIS לומינה XR (Caliper מכשירים), שניתן להשתמש בהם כדי לספק אנרגיה נמוכה (1-3 milligray (mGy)) ברזולוציה גבוהה, בהגדלה גבוהה רנטגן תמונות של עצמות הגפיים האחוריות בעכבר לאורך זמן לאחר SCI. אובדן משמעותי בצפיפות העצם נצפתה tibiae של עכברים על ידי 10 ימים לאחר חיתוך רוחב השדרה בהשוואה מלאה וללא כל פגע גיל בהתאמה, (נאיבי) עכברים (13% ירידה, p <0.0005). אובדן צפיפות העצם בעצם הירך הדיסטלית גם לזיהוי על ידי 10 יום שלאחר SCI, בעוד הפסד של צפיפות עצם הירך הפרוקסימלית, לא היה ניתן לגילוי עד 40 ימים שלאחר פציעה (ירידה של 7%, p <0.05). SCI תלויי אובדן צפיפות עצם הירך עכבר אושרה שלאחר המוות באמצעות Dual-X-ray אנרגיה (DXA) absorptiometry, את "תקן הזהב" הנוכחי עבור מדידות צפיפות העצם. אנו מזהים אובדן 12% BMC את עצמות הירך של עכברים ב 40 יום שלאחר SCI באמצעות IVIS לומינה XR. זאת, לעומת לטובה עם הפסד BMC שדווח בעבר של 13.5% על ידי פיקארד וחבריו שנהגו ניתוח DXA על העכבר עצמות הירך שלאחר המוות 30 הימים שלאחר SCI ^9. התוצאות שלנו מראים כי IVIS לומינה XR מספק רומן, שיטה high-resolution/high-magnification לביצוע לטווח ארוך, מידות האורך של איבר האחוריות צפיפות העצם עכבר הבאה SCI.

Protocol

1. עכבר השדרה מודל חיתוך רוחב , זכר מבוגר, C57BL6 עכברים (כ 20-25 גרם) מורדמים באמצעות שילוב של קטמין (200 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). כל הנהלים כירורגית מבוצעים חבילת מוסדיים IACUC המאושרות, ניתוח בתנאים סטריליים. לאחר בהרדמה עמוקה, הפרווה של הגב חיתוך באמצעות קוצץ חשמלי. הגב מגולח הוא שפשף הראשון עם פתרון יוד ואחריו אתנול 70%. לפני החתך הראשוני, באזור האחורי להיות חרות היא הסתננו הראשון בריכוז של (0.25%, <1ml> כפתור עיון. בתיבת הדו שיח שתופיע, בחר את התיקייה של הריבית ולחץ על אישור. הדפדפן מציג תמונה חיה את הנתונים הנבחרים יחד עם מזהה את המשתמש, מידע התווית, ותצורה מידע מצלמה. כדי לפתוח נתונים, בצע אחת מהפעולות הבאות: לחץ לחיצה כפולה על שורת נתונים, לחץ לחיצה ימנית על שם נתונים ובחר טען בתפריט הקיצור, בחר את השורה נתונים ולחץ Load, או לחץ פעמיים על התמונה הממוזערת. צבעים דמותה כלי מוצגים. נתוני פתיחה מסומן בירוק בדפדפן. לחץ על כלים ROI בלוח כלי. בשנת כלים ROI, ההחזר על ההשקעה לבחור בין מדידה הקלד את הרשימה הנפתחת. כדי לטעון את ההחזר על ההשקעה של 3 השתמשו בניסוי זה, לחץ על הסמל כיכר לטעון 3 ריבועים. באמצעות סרגל, מודדים את אורך עצם הירך. התאם את אורך של שני הריבועים להיות ה 1 / 8 של אורך עצם הירך הכולל. התאם את רוחב של שני ריבועים להיות 1/24th את אורך עצם הירך הכולל. עם השליט שלכם, 08/01 מדד ה של המרחק מן הקצה הפרוקסימלי של עצם הירך, ו – למקם את הכיכר כך מרוכז בתוך עצם הירך. ממקמים את הריבוע השני כך טמונה 1/4th של אורך עצם הירך הכולל מקצה הדיסטלי של עצם הירך (איור 3). ההחזר על ההשקעה של אלה ניתן להשתמש כדי למדוד אזורים הירך הן הפרוקסימלית ומ הדיסטלי. באמצעות הסרגל, למדוד את אורך עצם השוק. התאם את אורך הריבוע השלישי להיות ה 1 / 8 של אורך השוקה מוחלט. התאם את רוחב ה 1 / 30 של אורך השוקה מוחלט. ממקמים את הריבוע כך מרוכז ו 1 / 8 th את האורך הכולל של המרחק השוקה מסוף הפרוקסימלי של עצם השוק (ראה איור 3). לחץ על הסמל מדוד (עיפרון שליט). מדידות עוצמת ההחזר על ההשקעה להופיע בתמונה רנטגן לשולחן מדידות ROI מופיע. ייצוא טבלה זו לאo המיקום הרצוי כקובץ csv.. זה יאפשר לך לפתוח את הטבלה באמצעות Excel. חזור על פעולה זו עם כל התמונות השמורות שלך. איחוד כל הנתונים על גיליון אקסל אחד. משמעות סטטיסטיים נקבע באמצעות מבחן t-של התלמיד או באמצעות Microsoft Excel או SigmaPlot 11.0 תוכנה (Software Systat). 4. פוסט מורטם ניתוח של צפיפות העצם: בעקבות הרכישה האחרונה של אורכית רנטגן לסרוק בתוך IVIS לומינה XR, עכברים לאחר מכן הם בהרדמה עמוקה עם Beuthanasia (75 מ"ג pentobarbital / ק"ג). לאחר הרדמה עמוקה הושגה, העכברים הם perfused transcardially עם קרח קר פוספט שנאגרו מלוחים עם heparain (40 מ"ג / ליטר) כדי ולגרום לדימום מחודש. Exsanguinated פעם, הבלו הן עצמות הירך. שימו טיפול מיוחד כדי להסיר רקמה רכה ככל האפשר, בשביל זה הוכח להשפיע על מדידות צפיפות 11. עטפו את עצמות הירך עם גזה ספוג מים בחנות ובבית-20C עד שאתה מוכן לנתח אותם. 5. DXA ניתוח באמצעות Hologic QDR 4000 צפיפות עצם גזה ספוג הפשירי עצמות הירך ולהעביר לחבילת צפיפות העצם. כייל את המכשיר על פי פרוטוקול של היצרן, להבטיח את ערכי BMC ו – BMD נופלים בתוך גבולות מקובלים. מניחים collimator פליז במכונה. זה מאפשר למשתמש להגביל את הגודל והזווית של אלומת קרני ה-X להתמקד ביעד מסוים. להטביע את עצם הירך מופשר לתוך צלחת פטרי מלא מים (condyles שמאלה, במקביל עם הירך למיטה), ואת המיקום זה רק בצד ימין של הלייזר. הזן ביוגרפיה (כותרת תיאורי הכולל מידע זיהוי וטיפול בבעלי חיים, וכו ') על עצם הירך שאתם עומדים לסרוק. הזן סרוק מתוך תפריט הבחירות, ולאחר מכן בחר regionA Hi-res. ציין פרמטרים סריקה שלך: סריקה באזור של 0.7489 x 2 אינצ'ים, עם קו המרווח 0.01 אינץ ברזולוציה 0.00499 נקודת אינץ. הערה: צג הסריקה כאשר היא מתבצעת. כמו רנטגן הקורה סריקה סריקות המדגם, לפקח על מנת להבטיח כי יש מספיק מים בחדר כדי לכסות לחלוטין את המדגם העצם. הזן ניתוח תחת תפריט לבחירה ניתוח. בצע את ההנחיות כדי להדגיש את עצם הירך כולו ההחזר על ההשקעה. דף הדו"ח יעלה עם BMC מחושב (גרם) BMD (גרם / ס"מ 2). חזור על שלבים אלה כדי לנתח את עצמות הירך הנותרים. איחוד כל הנתונים על גיליון Excel אחד לבצע ניתוח סטטיסטי (t-test). 6. נציג תוצאות: צפיפות העצם יחסית אובדן של עצם השוק עכבר הירך לאחר פגיעה בחוט השדרה בהשוואה לעכברים נאיבי ניתן לזהות באמצעות השיטה הנ"ל. יש ירידה משמעותית בצפיפות העצם לזיהוי לאחררק 10 ימים (12%, p <0.0005), עם עד 15% אובדן צפיפות העצם בגיל 40 ימים (p <0.0005, איור 4). צפיפות העצם אובדן עצם הירך נצפתה ב 40 הימים שלאחר פציעה (ירידה של 7%, p <0.05, איור 5). תוצאות אלו מספקות ראיות לשימוש הדמיה רנטגן פולשני לצורך השגחה האורך של שינוי צפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה. על מנת להשוות את היעילות של שיטה זו על מה זמין כעת, ניתחנו את עצמות הירך נכרת של עכברים אלה 40 ימים לאחר פציעה באמצעות DXA הדמיה. ייצוג של פלט את הנתונים ניתן לראות באיור 6. מצאנו כי חלה ירידה משמעותית של תוכן העצם בעכברים SCI בהשוואה נאיבי (12% ירידה, p <0.05, איור 7). צפיפות העצם לא השתנה משמעותית, אבל לא פעל מגמה דומה (איור 8). תוצאות אלו דומים לאלה שנמצאו בספרות; פיקארד ואח' נצפתה ירידה של 13.5% (p <0.001) ב-BMC, אבל decr לא משמעותיהקלות BMD (פיקארד 2008). באיור 1. ציר הזמן ניסויית. איור 2 אוריינטציה נציג של איבר האחוריות השמאלית:. תמונה) ו-b) x-ray. באיור 3. ממדים ROI והתמצאות בתוך האזורים של עצם הירך עצם השוק הפרוקסימלית ומ. איור 4. אובדן צפיפות העצם לאחר SCI של הטיביה הפרוקסימלית, 10, 20, 30 ו – 40 ימים לאחר פציעה (n = 5) לעומת גיל בהתאמה naives (n = 5). ברים שגיאה מייצגים SEM; ** p <0.005, *** p <0.0005. <strong> איור 5. אובדן צפיפות העצם לאחר SCI בעצם הירך הפרוקסימלית, 10, 20, 30 ו – 40 ימים לאחר פציעה (n = 5) לעומת גיל בהתאמה naives (n = 5). ברים שגיאה מייצגים SEM; * p <0.05. איור 6. צפיפות העצם לאחר אובדן SCI ב הירך הדיסטלי ימים 10, 20, 30 ו 40 לאחר פציעה (n = 5) לעומת גיל בהתאמה שולטת נאיבית (n = 5). ברים שגיאה מייצגים SEM; * p <0.01-0.05; ** p <0.001-0.01; *** p <0.0001-0.001; **** p <0.0001. איור 7. התמונה נציג נתונים DXA מראה BMC ו – BMD פלט. איור 8. ניתוח DXA של תכולת המינרלים בעצמות (גרם) של עצמות הירך של עכברים SCI 40 ימים שלאחר פציעה (n = 5) לעומת גיל בהתאמה naives (n = 5).ברים שגיאה מייצגים SEM; * p <0.05. איור 9. ניתוח DXA של צפיפות העצם (מ"ג / ס"מ 2) של עצמות הירך של עכברים SCI 40 ימים שלאחר פציעה (n = 5) לעומת גיל בהתאמה naives (n = 5). ברים שגיאה מייצגים SEM, הבדל משמעותי.

Discussion

מחקר זה מציג רומן, פולשני שיטה להערכת שינויים בצפיפות בתוך עצמות אדם (tibiae ואת עצמות הירך) longitudinally, בתוך קבוצה אחת של עכברים, באמצעות IVIS Caliper לומינה XR מערכת הדמיה. SCI המיוצר ירידה בצפיפות העצם בשתי עצמות הירך לבין tibiae כאשר חקרו בתוך קבוצה אחת של spinally-transected העכברים לאורך תקופה assay 40 יום לעומת גיל בהתאמה, וללא כל פגע עכברים שליטה. התוצאות שלנו ב הירך אושרו, שלאחר המוות, באמצעות DXA, טוען כי הבקשה של מכשירים Caliper IVIS לומינה XR יכול לשמש ככלי מדידה רגיש כדי להעריך את ההשפעות לטווח ארוך ומתקדמת של SCI על איבוד מסת העצם .

אחד היתרונות הפוטנציאליים החוקרים באמצעות מערכת זו היא היכולת longitudinally לעקוב אחר התפתחות של שינויים פתולוגיים בעצמות הגפיים האחוריות של בעלי החיים לאחר SCI. היכולת להעריך קבוצה אחת על פני תקופות זמן מספק רחוביתרונות rong לחוקר במונחים של: 1) העלויות הכרוכות ברכישת חיות סיעודי. במקום מחקר הדורשים מספר רב של בעלי חיים כי צריך להקריב בנקודות זמן ספציפיות על מנת להעריך שינויים תלויי זמן, תוצאות אלו פתולוגי ניתן בעקבות בתוך קבוצה זאת על פני תקופה כי באותו זמן, 2) שונות: בנוסף השוואה עם קבוצות בקרה, תוצאות שנוצר בתוך הדור יחיד של נושאים נפצעו ניתן להעריך ולהשוות בין נקודות זמן החיות אותו לאורך כל היקף המחקר, שוב, הפחתת שתי השתנות פנים בעלי חיים, כמו גם את הצורך גדול קבוצות של נושאים ניסיוני.

בעוד IVIS Caliper לומינה XR סיפקו לנו מידע חשוב האורך לגבי התפתחות אוסטאופורוזיס SCI-Induced, קיימות מגבלות שיש לשקול: 1) בעוד פלטפורמה זו אפשרה לנו ליצור ברזולוציה גבוהה רנטגן datבעצמות הגפיים האחוריות של עכברים לאחר SCI, השירות שלה עשוי להיות מוגבל מכרסמים קטנים כגון עכברים. הגובה נושא המרבי המותר בתוך XR לומינה הוא 2.8 ס"מ. כל דבר מעל גובה שלא ניתן צילמו בהצלחה באמצעות רכיב ה-X של XR לומינה. בידיים שלנו, זה מנע את היכולת שלנו ללמוד חולדות במשקל 200-250 גרם. אמנם ייתכן שניתן חולדות תמונה תחת טווח זה משקל או מכרסמים אחרים, כגון אוגרים או גרבילים, זה יחייב בדיקות נוספות על ידי PI. 2) Joint אוריינטציה. זה קריטי, כי החוקר בקפידה לסדר את אברים באוריינטציה לשחזור בקלות שיאפשר השוואה מוצלחת בין הפגישות הדמיה. סטנדרטיזציה של מיקום האיבר יאפשר החוקר להפיק וליישם סטנדרטית של ROI כי ניתן לשמור ו מיושם על שני נושאים וזמן.

בסך הכל, אנו מאמינים כי IVIS לומינה XR מספק פלטפורמה מצוינת שבה המודלהתפתחות אוסטאופורוזיס SCI תלויי בעכברים. היכולת ללמוד איבוד מסת העצם longitudinally בתוך הדור עכבר זהה יאפשר לנו: 1) להבין טוב יותר את האופי הזמני של איבוד מסת העצם ואת איבוד מינרלים לאחר SCI, 2) לקבוע אם שינויים אלה לייצב לאורך זמן, 3) לחקור, עם הזמינות של שני קווי עכבר מהונדס null, את היכולת ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אלה שינויים פתולוגיים בצורה רדוקציוניסטית, ו 4) ייתכן מאוד את היתרון החשוב ביותר, מתחילים לבדוק התערבויות הרומן נועד גם למנוע התפתחות של אוסטאופורוזיס בשלבים המוקדמים הפציעה, או להפוך שינויים כאלה פעם אוסטאופורוזיס כבר פיתח. לבסוף, XR לומינה, בנוסף לספק פוטנציאל מעולה הדמיה רנטגן, יכול לשמש גם כדי ללמוד הן אותות bioluminescent ו ניאון בעלי חיים. אפשר בקלות לדמיין שילוב שיטות אחרות המוצעות בתוך המערכת הזאת להסתכל מולtitude של הגורמים הקובעים הדינמיקה עצם מכניסטי הבאים SCI או כל מחלה אחרת בתהליך המביא לאוסטיאופורוזיס.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Beuthanasia	Butler Schein Animal Health	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Schein Animal Health	023061
Xylazine	Butler Schein Animal Health	037849
Bupivicaine	Butler Schein Animal Health	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production