Summary
У мышей способность обнаруживать феромоны в основном при посредничестве вомероназального орган (ВНО). Здесь, острый срез подготовки ткани для проведения ВНО кальция изображений описан. Эта физиологическая подход позволяет наблюдений субпопуляций и / или отдельных нейронов в живой ткани и удобен для рецептор-лиганд идентификации.
Protocol
1. Препарирование мышей ВНО
- Использование взрослых мышей. Как феромона зондирования замешана в multimodalities, тщательное различие между штаммами, генотипы, пола и возраста имеет важное значение и будет влиять на ваши результаты. Здесь, мы решили взрослых мышей В. 30 ранее использовались для идентификации феромон-рецепторов паре (2-heptanone-V1rb2) 31 (рис. 1А).
- Перед началом вскрытия, подготовки свежей холодной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF; NaCl 118 мм, NaHCO 3 25 мм, D-глюкозы 10 мМ KCl 2 мМ, MgCl 2 2 мМ NaH 2 PO 4 1,2 мМ CaCl 2 2 мМ, рН 7,4), насыщенный oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). Для этого смешайте все компоненты, за исключением ACSF CaCl 2. Пропитайте решения, непосредственно восходящей его oxycarbon. В конце добавить CaCl 2 и отрегулировать с DDH 2 0 до желаемого объема. Хранить раствор ACSF на льду, пока укак таковой.
- Эвтаназия в мышь должна быть преимущественно сделано шейки дислокации или CO 2 ингаляции перед экспериментом.
- Вырезать мышь головы. Поместите его под микроскопом рассекает в холодной ACSF непрерывно oxycarbonated.
- Отрежьте нижнюю челюсть и положение головы для того, чтобы визуализировать неба (рис. 1б).
- Сделайте разрез горизонтально в верхней части неба (рис. 1б) с микро-ножницы и удалить неба мембраны с микро рассекает щипцами. Гидратов и чистой подвергается полости с ACSF (рис. 1в).
- Отрежьте верхнюю и нижнюю часть носовой перегородки (рис. 1в). Деликатно экстракт носовой перегородки содержащие ВНО и поместить его прямо в ACSF на льду (рис. 1D).
- Отдельные вертикально две части ВНО с использованием микро рассекает пинцетом и аккуратно удалить хрящевую капсулу ВНО (Рис. 1E). Убедитесь, что все хрящевые части удаляются.
2. ВНО ткани срез подготовки
Ломтик ВНО подготовки ткани, описанные в данном разделе 2) предназначен в основном для исследования кальция изображений. ВНО ломтиками также может быть использован для immunohistostainings на плавучих ломтиками для проверки структурной целостности тканей (см. раздел 3) из протокола).
- Подготовка легкоплавких агар (3% в стандартных PBS) и рабочее место. Вам нужно будет ACSF, микротома и поддерживает, микро рассекает щипцы, вложение формы (22 х 22 х 20 мм), точность салфетки, щетки, тарелки культуре тканей, cyanacrylat клей, льда и термометр.
- Заполните форму вложения с 3% легкоплавких агара. Убедитесь, что температура не выше 41 ° C до размещения вертикально вскоре уничтожены ВНО (рис. 2), чтобы иметь возможность получить корональных ломтиками.
- Место вложение плесень на льдув течение 1 мин до затвердевания, а затем отделить его от агара блока. Вырезать агар блока в пирамидальную форму и разместить его с клеем на микротома поддержки (рис. 2В).
- Вырезать корональных ломтиками ВНО с микротома, со скоростью 0,5 мм / с, амплитуда 0,7 мм и толщиной 100 мкм в холодной ACSF и собирать срезах тканей с кистью перед помещением их в пластину культуре ткани заполнены холодной ACSF.
- Если ваш ломтики содержать эндогенные флуоресценции, как GFP (в ген-целевых нейронов) вы можете выбрать их под люминесцентными стереомикроскопа (рис. 2).
3. Immunohistochemistry на ВНО плавающие ломтики
Целью этой процедуры является проверка целостности ткани ВНО ломтиками, полученные в разделе 2). Ацетилированный-тубулина является микротрубочек / цитоскелета маркер выражается в дендритов и микроворсинки ВНО сенсорных нейронов. Для экспериментов кальция изображений, перейдите направленииTLY раздел 4) протокола. Immunohistostaining метод плавающей ломтиками ВНО может быть адаптирована к оценке выражения какого-либо белка, представляющих интерес. Для этого, мы рекомендуем вам исправить ВНО в течение 1 ч при температуре 4 ° С в фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) после точки 1,7) протокола и использовать с этой точки PBS при рН 7,6, а не ACSF решение.
- В пластине культуре ткани, исправить ваши ломтики интерес к фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) 1 час при температуре 4 ° C.
- Блок ваши срезы тканей ночи при 4 ° С в растворе PBS, содержащего NGS (обычный козел сыворотки) 10% и тритона Х-100 на уровне 0,5%.
- Инкубируйте ломтики с первичными антителами (анти-ацетилированного-тубулина, Мышь, 1:2000) для 16h при комнатной температуре (RT) в растворе PBS, содержащего NGS 5% и Тритон Х-100 на 0,25%.
- Промыть 3 раза в течение 5 минут с раствором PBS, содержащего NGS 2%.
- Инкубировать в темноте с SECOndary антител (Cy5-сопряженных антимышиного, 1:200) в растворе PBS, содержащего NGS 2% в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза в течение 5 минут с PBS содержащие NGS 2%, PBS NGS 1% и только PBS.
- Смонтируйте ломтики в флуоресцентные монтажа СМИ (содержащие или не DAPI), поместив их в центре гидрофобные зоны запятыми (использование гидрофобных ручкой) и сопроводительное ломтики покровные.
- Провести наблюдения и поглощений с конфокальной микроскопии и программного обеспечения, позволяющего 3D реконструкции (рис. 2D-F).
4. Кальций изображения на кусочки ВНО
- Следующие процедуры будут проходить в темное время суток. Инкубируйте ВНО ломтики в течение 1 ч при температуре 37 ° С в загрузке раствор, состоящий из холодных ACSF с Фура-2 утра (7 мкМ; маточного раствора 1 мМ в ДМСО) и плуроник 0,1% (м / о; маточного раствора на 20% в DDH 2 O).
- Держите загружены ломтики на льду с oxycarbonation до использования. Загружено ломтиками может храниться в течение3-4h.
- Место загружены ломтики с кистью в перфузионной камере, содержащей ACSF и поддерживать ломтики с якоря ткани срез (рис. 3А).
- Место перфузии камеры на стадии микроскоп кальция томография (рис. 3В) и постоянно обрызгивать с oxycarbonated ACSF при комнатной температуре. Температура может быть адаптирована с использованием регулятора температуры биполярного.
- Наблюдения загружены ломтиками ВНО (рис. 3C-E) выполняются с перевернутой флуоресцентного микроскопа, с 25x или 63x объективных и CooL SNAP-HQ камеры. Освещение осуществляется последовательно (340/380 нм) с инструментом полихроматор и записаны со скоростью 5 Гц. Фильтрованный выбросов осуществляется при 510 нм. Внутриклеточного кальция соотношение изменяется (ΔF = 340 nm/380 нм) контролируются с соответствующим программным обеспечением.
- Chemostimulation должны быть выбраны в соответствии с вашими экспериментальных целях. Здесь перфузии из ACSF содержащие феромоны мIX (изобутиламина, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-гептанола, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 М), 2-heptanone (10 -6 М) или только что собранных мужские и женские (1: 1) мышь мочи (1:100) выполняются 32. Перфузии АТФ (125 мкМ) используется как жизнеспособность тест в конце эксперимента (рис. 3F) и указать, доля около 80% жизнеспособных нейронов. В этих условиях, кусочки можно использовать до 2-х часов.
- GFP с метками субпопуляций сенсорные нейроны визуализируются конкретными освещения (здесь V1rb2 выражения нейронов) и может быть проанализирована точно (рис. 3G-I).
5. Представитель Результаты:
Для создания функционального анализа для исследования несколько путей трансдукции, происходящие в ВНО мыши, или для выявления новых феромон-рецепторов пар, мы воспользуемся В. Г. мыши линии (рис. 1А (рис. 1E), мы готовим острые ломтики ВНО (рис. 2). Зафиксируем часть из них, с тем чтобы проверить и подтвердить тканевой целостности подготовки, выполняя immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка (рис. 2D-F). Другая часть из ломтиков используется для экспериментов кальция изображений. Для этого ломтики загружаются с Фура-2 утра (рис. 3C-E) и внутриклеточного уровня кальция каждого нейрона контролируется как отношение ΔF (рис. 3F). Жизнеспособность нейронов оценивается перфузии АТФ (125 мкМ), после чего быстрое и кратковременное повышение отношения ΔF ожидается (рис. 3F). Моча будучи основным источником феромонов, перфузии свежейЛи собрал мыши мочи (1:100) используется в качестве эндогенного контроля. Это вызывает кальция переходных процессов в примерно 50% от записанного нейронов (ячейка 1 и 2, рис. 3F). Под GFP освещения, V1Rb2 положительные нейронов наблюдаются и перфузии ее известных феромонов лиганд, 2-heptanone, инициирует активации клеток (ячейка 1, рис. 3I). Интересно, что нейронные активаций также наблюдается в доле нейронов, которые не выражают V1Rb2 рецепторов (GFP отрицательный нейроны) (ячейка 2, рис. 3I), демонстрируя сложность кодирования феромонов в ВНО.
Рисунок 1. Препарирование орган мыши вомероназального. (A) мышь от линии VG. (B) После эвтаназии мыши, полный голова находится под бинокулярным микроскопом и нижней челюсти удаляется для того, чтобы визуализировать неба. Небольшой горизонтальный разрез делается(Черная пунктирная линия). (C) После удаления неба, носовой перегородки выстланы ВНО разрезается в верхней и нижней части (белый пунктир) для облегчения ВНО добычи. (D) ВНО находится в растворе ACSF и отделены (вставить: высшая сила зрения двух частей). (E) хрящевая капсула ВНО является деликатно удаляют и ВНО без хрящевой капсулы используется для остальной части экспериментов. Шкала бары: BE, 1 мм.
Рисунок 2. Мышь вомероназального острых подготовки нарезать и тканевой целостности. (А) ВНО мыши вертикально встроенных в агар 3% раствора. Температура агара должна быть ниже 41 ° C. (B) агар блок режут на пирамидальную форму и 100 мкм ВНО разделах (черный пунктир) генерируются в ACSF. (C) ВНО ломтиками может быть выбран под флуоресцентным стереомикроскопа для визуализации конкретныхНаселение меченых сенсорных нейронов. (DF) тканевой целостности можно оценить по immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка, увеличению мощности зрения V1rb2 гена ориентированных нейроны демонстрируют идеальное сохранение подготовки. Нейроны с длинными дендритов, достигающего поверхности просвета (E), а также выражение структурного белка в дендритные ручки и микроворсинок можно наблюдать (F). Шкала бары: В, 5 мм; С, 60 мкм, D, 40 мкм, EF, 20 мкм.
Рисунок 3. Изображений Кальций и феромонов обнаружения в вомероназального острые ломтики тканей. () После Фура-2 утра загрузочной фазы, ВНО ломтиков помещают в перфузионной камере и поддерживаются с адаптированной якорь (высокий зрения власти). (Б) Эксперименты проводятся в темное и ВНО ломтиками постоянно озарен ACSF при комнатной температуре с вакуумной системой. Температура может быть Chosан с помощью системы регулятор температуры составленный элемент Пельтье и биполярного тепловой датчик. Данный эксперимент проводился при комнатной температуре. (CE), ВНО ломтики наблюдаемых под Хоффман фазового контраста (С, Hv) или 380 нм Фура освещения перед (D) и во время активации нейронов (E, здесь с АТФ). (F) нейронов жизнеспособность оценивается с перфузии АТФ (125 мкМ). Здесь chemostimulation осуществляется с мочой (моча, 1:100) или смесью мыши феромоны (смесь тел., 10 -6 М) с постоянной скоростью потока 165 мл / ч. Внутриклеточного уровня кальция (ΔF) могут быть записаны отдельно для каждой ячейки (Cell с 1 по 3). (G) нейрона V1Rb2 визуализируется при освещении GFP (1). (H) загрузку этого нейрона (1), а также не-V1rb2 выражения нейрона (2), показано на рисунке. (I) нейрона V1rb2 в состоянии ответить на 2-heptanone с увеличением внутриклеточного кальция. Это особенно не-V1rb2 выражения нейрон реагирует также на 2-heptanone (клетка 2). Шкала бары: CE, 20 мкм; GH,15 мкм; ΔF = 340 нм / 380 нм. (F и I) Продолжительность стимулом приложения указывается баров под каждым следа. Произвольном масштабе цвет соответствует интенсивности флуоресценции.
Discussion
Метод визуализации кальция, представленные здесь позволяет записывать, в остром подготовки ломтик, феромонов ответы нейронов мыши ВНО. При таком подходе, рассечение от животного к вомероназального нейронов, с некоторой практикой, легко достижимо и дает долгоживущих подготовки ткани. Он позволяет много времени эксперименты, как фармакологические исследования или изучения феромонов кодирования. При этом физиологические техники, большой численностью населения, а также точный нейронных субпопуляций могут быть проанализированы в частности. Кроме того, этот метод может быть легко адаптирована к иммуногистохимического подходы или экспериментов, основанных на других красителей кальция. Использование этих комбинированных методик, безусловно, позволяют выявлению новых феромонов лигандами для многих хеморецепторы сирот выражается в орган мыши вомероназального.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить особенно Моник Nenniger Tosato за отличную техническую поддержку, а также Жан-Ив Чаттон за научные советы и платформы визуализации СИФ UNIL для микроскопа оборудования. Финансирование было предоставлено Швейцарского национального научного фонда.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck & Co., Inc. | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth GmbH | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |
References
- Karlson, P., Lüscher, M. "Pheromones" a new term for a class of biologically active substances. Nature. 183, 55-56 (1959).
- Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).
- Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus. Experientia. 46, 109-113 (1990).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals. Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).
- Achiraman, S., Archunan, G. Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds. J. Biosci. 27, 679-686 (2002).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).
- Brennan, P. A., Zufall, F.
Pheromonal communication in vertebrates. Nature. 444, 308-315 (2006). - Mondor, E. B., Roitberg, B. D. Inclusive fitness benefits of scent-marking predators. Proc. Biol. Sci. 271, Suppl 5. 341-343 (2004).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Keverne, E. B.
The Vomeronasal Organ. Science. 286, 716-720 (1999). - Weiler, E. Postnatal development of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 30, Suppl 1. 127-128 (2005).
- Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).
- Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa. Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Cell. 19, 371-379 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. Extreme variability among mammalian V1R gene families. Genome. Res. 20, 10-18 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).
- Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing. Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97, 199-208 (1999).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).
- Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice. Science. 321, 1092-1095 (2008).