Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora
Summary
Un método para supervisar la actividad de ubiquitina-proteasoma en células vivas se describe. Un degron-GFP desestabilizado-(GFP-dgn) y una estable GFP-dgnFS proteína de fusión se generan y se transduce en la célula usando un vector de expresión lentiviral. Esta técnica permite generar un GFP-dgn/GFP-dgnFS estable línea celular que expresa en la que se puede ubiquitina-proteasoma actividad fácilmente evaluada utilizando epifluorescencia o citometría de flujo.
Abstract
Proteasoma es el principal organelo intracelular implicada en la degradación proteolítica de proteínas anormales, mal dobladas, dañadas u oxidadas 1, 2. El mantenimiento de la actividad del proteasoma fue implicado en muchos procesos celulares clave, como respuesta al estrés celular 3, la regulación del ciclo celular y la diferenciación celular 4 o en la respuesta del sistema inmune 5. La disfunción del sistema ubiquitina-proteasoma se ha relacionado con el desarrollo de tumores y enfermedades neurodegenerativas 4, 6. Además, una disminución en la actividad del proteasoma se encontró como una característica de la senescencia celular y el envejecimiento organismal 7, 8, 9, 10. A continuación, se presenta un método para medir la actividad ubiquitina-proteasoma en células vivas utilizando una proteína de fusión GFP-dgn. Para ser capaz de controlar la actividad de la ubiquitina-proteasoma en células vivas primarias, ADN complementario construye codifica para una proteína fluorescente verde (GFP)-dgn proteína de fusión (GFP-dgn, inestable) y una variante con una mutación de desplazamiento de marco (GFP-dgnFS, estable 11) se insertan en vectores de expresión lentiviral. Se prefiere esta técnica sobre técnicas de transfección tradicionales, ya que garantiza una eficacia de transfección muy alta independiente del tipo de célula o de la edad del donante. La diferencia entre la fluorescencia mostrada por el GFP-dgnFS (estable) de proteína y la proteína de desestabilizado (GFP-dgn) en ausencia o presencia de inhibidor del proteasoma puede ser utilizado para estimar la ubiquitina-proteasoma actividad en cada cepa de célula particular. Estas diferencias pueden ser supervisado por microscopía de epifluorescencia o puede ser medido por citometría de flujo.
Protocol
Discussion
La primera publicación utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como sustrato reportero de ubiquitina-proteasoma actividad se publicó en 2000 12. Desde entonces, GFP se ha convertido en una herramienta común para visualizar las actividades celulares, especialmente el proceso de ubiquitina-proteasoma. Para supervisar la ubiquitina-proteasoma actividad in vivo de un modelo de ratón transgénico con un reportero GFP basada ha introducido 13. Adicional a la investigación …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por: Red Nacional de Investigación sobre el Envejecimiento (NFN S93) por la Fundación de Ciencias de Austria (FMF), Comisión Europea Integrada de Proyectos y MiMAGE PROTEOMAGE, Países Bajos Genómica Iniciativa / Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (IGN / NWO, 05040202 y 050 – 060-810 NCHA), financiado por la UE Red de Excelencia Duración (6 º PM 036.894) y el Programa de Innovación Tecnológica Orientada sobre Genómica (SenterNovem; IGE01014 y IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
Referências
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
