Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion
Summary
Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.
Abstract
TGF-β יש המתנגדים תפקידים התקדמות סרטן השד על ידי מתנהג כמו מדכאי גידול בשלב הראשוני, אבל מגרה הפלישה גרורות ב 1,2 בשלב מאוחר יותר. יתר על כן, TGF-β הוא overexpressed לעתים קרובות סרטן השד וביטויו בקורלציה עם תחזית גרועה וגרורות 3,4. המנגנונים שבאמצעותם TGF-β גורם הפלישה אינם מובנים היטב.
TGF-β מעורר תגובות הסלולר שלה באמצעות TGF-β מסוג II (TβRII) ואת סוג I (TβRI) קולטנים. עם היווצרות TGF-β-Induced מורכב heteromeric, TβRII phosphorylates TβRI. TβRI מופעל יוזם מסלול איתות תאיים הקנונית שלה על ידי Smads קולטן phosphorylating (R-Smads), כלומר Smad2 ו Smad3. אלה מופעלים R-Smads טופס מתחמי heteromeric עם Smad4, אשר מצטברים בגרעין ולווסת את שעתוק של גני מטרה 5. בנוסף ד בעברמסלול Smad escribed, הפעלת קולטן תוצאות ההפעלה של מספר אי – Smad מסלולים אחרים איתות, למשל Mitogen הופעל חלבון kinase (MAPK) 6 מסלולים.
כדי לחקור את תפקידה של TGF-β בשלבים שונים של סרטן השד, עשינו שימוש במערכת תא MCF10A. מערכת זו מורכבת הנציח ספונטני MCF10A1 (M1) בתאי אפיתל השד 7, הפך את H-M1-RAS נגזרת MCF10AneoT (M2), אשר מייצרת נגעים טרום ממאיר בעכברים 8, ו-M2 נגזרת MCF10CA1a (M4), אשר הוקמה מ xenografts M2 וצורות קרצינומות ציון גבוה עם היכולת ליצור גרורות לריאות 9. סדרה זו MCF10A מציע את האפשרות ללמוד את תגובותיהם של תאים עם דרגות שונות של ממאירות שאינם מוטים על ידי רקע גנטי שונה.
ניתוח הפלישה TGF-β-Induced, אנחנו שנוצר homotypic MCF10A embe תרבויות spheroid תאdded במטריצה קולגן 3D במבחנה (איור 1). מודלים כאלה דומים גידולים אנושיים in vivo על ידי הקמת שיפוע של חמצן וחומרים מזינים, וכתוצאה מכך התאים פעיל פולשני על תאים בחוץ שקט או אפילו נמקי בפנים של 10 spheroid. מבחני מבוסס Spheroid יש גם הוכח בצורה טובה יותר לסכם את עמידות לתרופות מאשר תרבויות monolayer 11. מערכת זו MCF10 מודל 3D אפשרה לנו לחקור את ההשפעה של איתות TGF-β על המאפיינים פולשני של תאים השד בשלבים שונים של ממאירות.
Protocol
Discussion
הקמנו מודל spheroid שבו MCF10A1 תאים ממאירים ונגזרות שלו לפלוש לתוך מטריצה קולגן בצורה TGF-β תלויים. ראשית, spheroids נוצרות 96-בארות ההשעיה בסיבוב צלחות התחתונה בנוכחות methylcellulose. כמובן, גם בצורת U מרובה המה צלחות מצופה יכול לשמש למטרה זו. Methylcellulose דרושה לחלוטין בשלב זה, שכן התאים …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קן איווטה (OSI Pharmaceuticals, ניו יורק, ארה"ב) עבור ריאגנטים פרד מילר (ברברה אן Intitute Karmanos סרטן, דטרויט, ארה"ב) על שורות תאים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
Referências
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer–a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
