Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion
Summary
Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.
Abstract
TGF-β tem papéis opostos na progressão do câncer de mama, agindo como um supressor de tumor na fase inicial, mas estimulando a invasão e metástase na tarde 1,2 palco. Além disso, o TGF-β é freqüentemente overexpressed no câncer de mama e sua expressão se correlaciona com o prognóstico pobre e metástases 3,4. Os mecanismos pelos quais TGF-β induz a invasão não são bem compreendidos.
TGF-β provoca suas reações celulares via TGF-β tipo II (TβRII) e eu tipo (TβRI) receptores. TGF-β sobre induzida por formação heteromeric complexo, TβRII fosforila o TβRI. O TβRI ativada inicia a sua via de sinalização intracelular canônica pela Smads receptor fosforilar (R-Smads), ou seja Smad2 e Smad3. Estes ativados R-Smads formam complexos com heteromeric Smad4, que se acumulam no núcleo e regulam a transcrição de genes-alvo 5. Além do anteriormente dvia Smad escribed, os resultados receptor de ativação na ativação de diversas outras organizações não-Smad vias de sinalização, por exemplo Mitógeno proteína quinase ativada (MAPK) Vias 6.
Para estudar o papel da TGF-β em diferentes estágios do câncer de mama, fizemos uso do sistema de célula MCF10A. Este sistema é composto de células espontaneamente imortalizado MCF10A1 (M1) de mama epiteliais 7, o H-RAS transformou M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produz lesões pré-malignas em camundongos 8, eo MCF10CA1a M2 derivados (M4), que foi estabelecida a partir de xenoenxertos M2 e os formulários de alto grau de carcinomas com a capacidade de metástase para o pulmão 9. Esta série MCF10A oferece a possibilidade de estudar as respostas de células com diferentes graus de malignidade que não são influenciados por uma base genética diferente.
Para a análise de TGF-β induzida por invasão, geramos homotypic MCF10A esferóide celular embe culturasdded em uma matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Tais modelos se assemelham tumores humanos in vivo, estabelecendo um gradiente de oxigênio e nutrientes, resultando em células ativas e invasiva sobre as células fora e quiescente ou mesmo necrose no interior dos 10 esferóide. Esferóide ensaios com base também foram mostrados para melhor recapitular resistência às drogas do que as culturas em monocamada 11. Este sistema MCF10 modelo 3D permite estudar o impacto do TGF-β sinalização nas propriedades invasivas das células de mama em estágios diferentes de malignidade.
Protocol
Discussion
Nós estabelecemos um modelo esferóide em que MCF10A1 células e seus derivados malignos invadem em uma matriz de colágeno de uma forma TGF-β-dependente. Primeiro, esferóides são formados em placas redondas de 96 poços de fundo de suspensão na presença de metilcelulose. Naturalmente, também em forma de U poli-HEMA placas revestidas podem ser usados para esta finalidade. Metilcelulose é absolutamente necessário nesta etapa, já que as células morrerão na ausência de metilcelulose. TGF-β é adicionado…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, EUA) para reagentes e Miller Fred (Barbara Ann Karmanos Cancer Intitute, Detroit, EUA) para as linhas de celular.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
Referências
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