Sfäroid analys för att mäta TGF-β-inducerad Invasion
Summary
En analys för att kvantitativt mäta Transforming Growth Factor (TGF)-β-inducerad invasionen i 3-dimensionella kollagen geler beskrivs. Denna analys drar fördel av MCF10A serie av cellinjer som representerar olika stadier av bröstcancer utveckling. Denna metod kan antas för att användas tillsammans med andra cellinjer och kan användas för att undersöka andra potentiella aktivatorer eller hämmare av invasion.
Abstract
TGF-β har motsatta roller i bröstcancer progression genom att fungera som en tumörsuppressor i det inledande skedet, men stimulerande invasion och metastasering i ett senare skede 1,2. Dessutom är TGF-β ofta överuttryckt i bröstcancer och dess uttryck korrelerar med dålig prognos och metastasering 3,4. De mekanismer genom vilka TGF-β inducerar invasion inte är välkända.
TGF-β framkallar sina cellulära svaren via TGF-β typ II (TβRII) och typ I (TβRI)-receptorer. Vid TGF-β-inducerad heteromeric komplexbildning, fosforylerar TβRII den TβRI. Den aktiverade TβRI inleder intracellulära kanoniska signalväg genom fosforylerande receptor Smads (R-Smads), dvs Smad2 och Smad3. Dessa aktiveras R-Smads formen heteromeric komplex med Smad4, som ackumuleras i cellkärnan och reglera transkription av mål gener 5. Förutom den tidigare described Smad väg, aktivering av receptorn resulterar i aktivering av flera andra icke-Smad signalvägar, till exempel mitogen aktiverat protein kinas (MAPK) vägar 6.
För att studera betydelsen av TGF-β i olika stadier av bröstcancer, gjorde vi användning av MCF10A cellen systemet. Detta system består av spontant förevigat MCF10A1 (M1) bröst epitelceller 7, förvandlade H-RAS M1-derivata MCF10AneoT (M2), som producerar premaligna lesioner hos möss 8 och M2-derivata MCF10CA1a (M4), som bildades ur M2 implanterad och bildar hög kvalitet carcinom med förmågan att metastasera till lungorna 9. Detta MCF10A serien erbjuder möjligheten att studera de svar av celler med olika grader av malignitet som inte är påverkade av en annan genetisk bakgrund.
För analys av TGF-β-inducerad invasionen genererade vi homotypic MCF10A sfäroid cellkulturer embedded i en 3D kollagenmatrisen in vitro (Fig. 1). Sådana modeller liknar mycket humana tumörer in vivo genom att etablera en gradient av syre och näringsämnen, vilket resulterar i ett aktivt och invasiva celler på utsidan och inaktiv eller nekrotiska celler i insidan av sfäroid 10. Sfäroid baserade analyser har också visat att bättre rekapitulera resistens än monolayer kulturer 11. Denna MCF10 3D-modell systemet tillät oss att undersöka effekten av TGF-β signalering på invasiva egenskaper bröst celler i olika stadier av malignitet.
Protocol
Discussion
Vi etablerade en sfäroid modell där MCF10A1 celler och maligna derivat invadera till en kollagenmatrisen i en TGF-β-beroende sätt. Först är spheroids bildas i 96-brunnar runda plattor botten fjädring i närvaro av metylcellulosa. Naturligtvis kan även U-formad poly-HEMA plåt användas för detta ändamål. Metylcellulosa är absolut krävs i detta steg, eftersom celler dör i avsaknad av metylcellulosa. TGF-β läggs direkt till kollagen-methocel blandning eftersom vi upptäckt att celler svarade sämre på TGF…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) för reagenser och Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Intitute, Detroit, USA) för cellinjer.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
Referências
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer–a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
