Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

Summary

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Abstract

Cálcio (Ca ^{2 +)} é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca ^{2 +} de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina ^1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CAM)} em oposição à sua Ca ^{2 +} estado livre (ApoCaM) ^3.

Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca ^{2 +-CaM,} algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, e miosinas certos <sup> 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica ^7, função pós-sinápticos ^8, e ⁹ a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca ^{2 +} é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca ^{2 +-CaM} e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina ^10, Ca ^{2 +} / CaM quinases dependentes (CaMKs) ¹¹ e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) ^12, e espectrina quinase ^13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante ^14.

Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca ^{2 +} forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca ^{2 +} forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica ^8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM.

Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca ^{2 +,} usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca ^{2 +} em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca ^{2 +} / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

Protocol

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas. 1. Preparação dos tecidos Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteín…

Discussion

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca ^{2 +} dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca ^{2 +} forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca ^{2 +.</su…}

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads