Ein Verfahren zur Foto-Verkapselung von Zellen in einer vernetzten PEG-Hydrogel beschrieben. Hypoxische Signalisierung innerhalb gekapselt murine Insulinom (MIN6) Aggregate verfolgt wird mit einem fluoreszierenden Marker-System. Dieses System ermöglicht serielle Untersuchung von Zellen in einem Hydrogel Gerüst und Korrelation von hypoxischen Signalisierung mit Veränderungen in der Zelle Phänotyp.
In Diabetes mellitus Typ 1, autoimmune Zerstörung der Bauchspeicheldrüse β-Zellen führt zu einem Verlust der Insulin-Produktion und potenziell tödlichen Hyperglykämie. Als alternative Behandlungsoption, um exogene Insulin-Injektion, hat die Transplantation von funktionell Pankreasgewebe wurde 1,2 erforscht. Dieser Ansatz bietet das Versprechen einer natürlicheren, langfristige Wiederherstellung der Normoglykämie. Schutz des Spenders Gewebe aus dem Immunsystem des Wirtes ist erforderlich, um zu verhindern Ablehnung und Kapselung ist eine Methode verwendet, um dieses Ziel zu erreichen.
Biologisch gewonnene Materialien, wie Alginat 3 und Agarose 4, haben die traditionelle Wahl für Kapsel Bau gewesen, aber kann eine Entzündung oder fibrotische Überwucherung 5, die Nährstoff-und Sauerstofftransport behindert auslösen können. Alternativ sind auch synthetische Poly (ethylenglycol) (PEG)-basierte Hydrogele nicht erniedrigend, leicht funktionalisiert, in hoher Reinheit zur Verfügung,haben steuerbaren Porengröße, und sind äußerst biokompatibel, 6,7,8. Als zusätzlichen Vorteil können PEG-Hydrogele schnell in einem einfachen Foto-Vernetzungsreaktion, der keine Anwendung von nicht-physiologischen Temperaturen 6,7 gebildet werden. Ein solches Vorgehen ist hier beschrieben. In der Vernetzungsreaktion, UV-Degradation des Photoinitiators, 1 – [4 – (2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-Hydroxy-2-methyl-1-Propan-1-on (Irgacure 2959), produziert freie Radikale, die Attacke der Vinyl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen zu Di-PEG (PEGDM) induzieren Vernetzung an den Kettenenden. Die Vernetzung kann innerhalb von 10 Minuten erreicht werden. PEG-Hydrogele in einer solchen Art und Weise aufgebaut haben gezeigt, dass positiv Stützzellen 7,9, und die geringe Photoinitiatorkonzentration und kurze Exposition gegenüber UV-Bestrahlung wirkt sich nicht nachteilig auf die Lebensfähigkeit und Funktion der eingekapselten Gewebe 10. Während wir unsere Methacrylat-PEG mit dem unten beschriebenen Verfahren können PEGDM auch directly von Herstellern wie Sigma bezogen.
Eine Konsequenz der Kapselung ist die Isolierung der Zellen aus einem Gefäßnetz. Zufuhr von Nährstoffen, vor allem Sauerstoff, wird somit reduziert und begrenzt durch Diffusion. Dies reduziert die Verfügbarkeit von Sauerstoff kann insbesondere Auswirkungen β-Zellen, deren Insulin-Sekretion ist stark abhängig von Sauerstoff 11-13. Capsule Zusammensetzung und Geometrie wird auch Auswirkungen Diffusionsraten und Längen für Sauerstoff. Deshalb beschreiben wir auch eine Technik zur Identifizierung von hypoxischen Zellen in unserem PEG-Kapseln. Die Infektion der Zellen mit einem rekombinanten Adenovirus kann für ein fluoreszierendes Signal erzeugt, wenn intrazelluläre Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) Wegen 14 sind aktiviert. Als HIFs die primäre Regulatoren der transkriptionellen Antwort auf Hypoxie sind, stellen sie ein ideales Ziel Marker für den Nachweis von Hypoxie-Signalisierung 15. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und schnelle Erkennung von HYPOXIc-Zellen. Kurz gesagt, hat das Adenovirus die Sequenz für ein rot fluoreszierendes Protein (Ds Red DR von Clontech) unter der Kontrolle eines Hypoxie-responsive element (HRE) Trimer. Stabilisierung von HIF-1 durch niedrigen Sauerstoffgehalt fahren Transkription des fluoreszierenden Proteins (Abbildung 1). Weitere Einzelheiten über den Bau des Virus wurden bisher 15 veröffentlicht. Das Virus ist in 10% Glycerin bei -80 ° C so viele 150 ul Aliquots in 1,5 ml Röhrchen in einer Konzentration von 3,4 x 10 10 pfu / mL.
Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass MIN6 Zellen als Aggregate ihre Lebensfähigkeit zu erhalten über 4 Wochen der Kultur in 20% Sauerstoff gekapselt. MIN6 Aggregate bei 2 kultiviert oder 1% Sauerstoff zeigten beide Zeichen von nekrotischen Zellen (immer noch etwa 85-90% lebensfähig) durch Färbung mit Ethidiumbromid sowie morphologische Veränderungen in Bezug auf Zellen in 20% Sauerstoff. Die glatte Kugelgestalt der Aggregate bei 20% angezeigt wurde lost und Aggregate erschien eher wie unorganisiert Gruppen von Zellen. Während die niedrigen Sauerstoff-Stress nicht verursacht einen ausgeprägten Rückgang der Rentabilität, ist es eindeutig Auswirkungen auf MIN6 Aggregation und Funktion als durch Glukose-stimulierte Insulinsekretion 15 gemessen. Western-Blot-Analyse der eingekapselten Zellen in 20% und 1% Sauerstoff zeigten ebenfalls eine signifikante Erhöhung der HIF-1α für Zellen in den niedrigen Sauerstoffgehalt, die mit dem Ausdruck des DsRed DR-Protein korreliert kultiviert.
Die hier vorgestellte Methode bietet eine schnelle und einfache Methode zur Verkapselung von Zellen in einer PEG-Hydrogel mit minimalem Einsatz nicht-physiologischen Bedingungen. PEG ist ein sehr nützliches Verkapselungsmaterial für seine Biokompatibilität und einfache Modifikation. Einfache Variation der PEG Prozentsatz in die photoaktive Lösung, zum Beispiel, kann verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften, wie Druck-Modul, und Transport-Eigenschaften durch Porengröße eingestellt werden. Außerdem ist PEG einfach durch die Zugabe von Seitenketten modifiziert. PEG-Hydrogele, also stellen beide eine viel versprechende klinische Gerät und eine flexible Plattform für in-vitro-Forschung
Eine Methode zur Verfolgung Hypoxie in PEG-verkapselten Zellen wurde ebenfalls vorgestellt. Diese Methode ist für die Einfachheit des Hypoxie-Erkennung und zur Vermeidung der Notwendigkeit, die Zellen von Interesse zu opfern nützlich. Die Technik kann auf eine Vielzahl von Zelltypen in einer Vielzahl von Bedingungen zu schaffen, ihre uns angewendet werdenefulness breit. Zum Beispiel kann eine Hypoxie als Stichwort für Stammzell-Differenzierung in der Stammzellforschung Micromass Kulturen verfolgt werden. Allerdings kann diese Methode nur angewandt, um Zellsysteme oder System, in dem Zellen später aggregiert verteilt dispergieren. Auch kann der Nachweis der Fluoreszenz-Signal werden in größeren oder dichteren Gewebe schwierig.
The authors have nothing to disclose.
Dank der Kristi Anseth Labor der University of Colorado, Boulder für die großzügige Bereitstellung MIN6 Zellen. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von der NSF zur Verfügung gestellt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |