Könscell Transplantation och testiklar Tissue Xenografting hos möss

Summary

Protokoll för könsceller transplantation och testiklar xenografting vävnad beskrivs. Könsceller transplantation resultat i givar-derived spermatogenes i mottagarländerna testiklar och representerar en funktionell beredning analys för identifiering av spermatogonial stamceller (SSC). Testikel vävnaden xenografting återger testiklar utveckling och spermatogenes av olika givare arter i mottagande möss.

Abstract

Könscell transplantation har utvecklats av Dr Ralph Brinster och kollegor vid University of Pennsylvania i 1994 ^1,2. Dessa banbrytande studier visade att mikroinjektion av könsceller från bördiga donatormöss i sädeskanalerna av alla infertila mottagande möss resulterar i givaren härlett spermatogenes och spermieproduktion av mottagaren djuret ^2. Användningen av donatordjur bär den bakteriella β-galaktosidasgenen möjliggjorde identifiering av givare härrörande spermatogenes och överföring av givare haplotypen till avkomman med mottagande djur ^1. Helt överraskande, efter transplantation in i lumen av sädeskanalernas tubuli, voro transplanterade könscellerna kunna röra sig från den luminala avdelningen till den källaren membranet där spermatogonier är belägna ^3. Det är allmänt godtas att förordningen enbart SSC: er är i stånd att kolonisera den nisch-och återupprätta spermatogenesen hos de mottagande testikel. Därför könscelltransplantation ger ett funktionellt synsätt för att studera den nisch stamceller i testiklarna och för att karakterisera förmodade spermatogonial stamceller. Till datum, är grodden celltransplantation användas för att belysa grundläggande biologi stamcell, att producera transgena djur igenom genetisk manipulering av könsceller före transplantation ^4,5, för att studera Sertolicellen-grodden cell-interaktion ^6,7, Rymdbolaget homing och kolonisering ^{3, 8,} samt SSC självförnyelse och differentiering ^9,10.

Könscell transplantation är också möjligt i stora arter ^11. I dessa är de huvudsakliga användningsområdena är bevarandet av fertilitet, spridning av elit genetik i djurpopulationer, och generering av transgena djur som studiet av spermatogenes och SSC biologi med denna teknik är logistiskt svårare och dyrare än hos gnagare. Transplantation av könsceller från stora arter i sädeskanalerna av möss leder till colonization av donerade celler och spermatogonial expansion, men inte i sin fulla differentiering förmodligen på grund av inkompatibilitet mellan mottagaren somatiska cellen fack med könscellerna från fylogenetiskt avlägsna arter ^12. Ett alternativt tillvägagångssätt är transplantation av könsceller från stora arter tillsammans med sin omgivning somatisk avdelning. Vi rapporterade först i 2002, att små fragment av testiklarna vävnad från omogna män transplanterade under dorsal huden immundefekta möss kan överleva och genomgå en fullständig utveckling med produktion av befruktning kompetent sperma ^13. Sedan dess har testiklarna vävnad xenografting har visat sig vara framgångsrik i många arter och framträdde som ett värdefullt alternativ för att studera testiklar utveckling och spermatogenes av stora djur i möss ^14.

Protocol

DEL A. könsceller transplantation hos möss 1. Beredning av mottagande möss Mottagarna ska vara immunologiskt toleranta (antingen genetiskt anpassade till givare eller immunbrist) till cellerna donator testiklar. Mottagarna ska antingen vara naturligt saknar spermatogenesen (t.ex. W / W v möss) eller utarmat av endogena könsceller. Hos könsceller utarmning kan uppnås genom att bestrålning eller kemoterapeutiska droger såsom Busulfan. I detta pro…

Discussion

1. Germ celltransplantation

Germ celltransplantation tillhandahåller den enda funktionell-analysen för otvetydig bekräftelse av närvaron av spermatogonial stamceller (SSC: er) i en cellpopulation. Endast SSC kan hem till och kolonisera SSC nisch vid basalmembranet och initiera donator-derived spermatogenesen. Könscell transplantation gjort det möjligt att studera och manipulera SSC på ett aldrig tidigare skådat sätt. Tekniken har använts för att framställa transgena djur genom gene…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896