Metaboliseringsvej Bekræftelse og Discovery Gennem 13 C-mærkning af proteinogene aminosyrer
Summary
13 C-isotop mærkning er en teknik til bestemmelse af cellens centrale stofskifte for forskellige typer af mikroorganismer. Efter at cellerne har været dyrket med en bestemt mærket substrat, kan GC-MS måling afslører funktionelle stofskifteveje baseret på unikke mærkning mønstre i proteinogene aminosyrer.
Abstract
Mikrober har komplekse metaboliske veje, som kan undersøges ved hjælp af biokemi og funktionel genomik metoder. En vigtig teknik til at undersøge cellens centrale stofskifte og opdage nye enzymer er 13 C-assisteret stofskifte analyse 1. Denne teknik er baseret på isotop-mærkning, hvor mikroorganismer er fodret med en 13 C-mærkede substrater. Ved at spore atomet overgangen stier mellem metabolitter i de biokemiske netværk, kan vi bestemme funktionelle veje og opdage nye enzymer.
Som en supplerende metode til at transcriptomics og proteomics, strategier for isotopomer-assisteret analyse af stofskifteveje indeholder tre vigtige trin 2. Først, vi vokser cellerne med 13 C-mærkede substrater. I dette trin, er sammensætningen af medium og udvælgelsen af mærkede substrater to vigtige faktorer. For at undgå måling støj fra ikke-mærkede kulstof i næringsstof kosttilskud, Er en minimal medie med en eneste kulstofkilde påkrævet. Endvidere er valget af en mærket substrat er baseret på, hvor effektivt det vil belyse den vej at blive analyseret. Fordi romanen enzymer ofte indebærer forskellige reaktioner stereokemi og halvfabrikata, i almindelighed, enkeltvis mærket kulstof substrater er mere informativ til påvisning af nye veje end ensartet mærket dem til påvisning af nye veje 3, 4. For det andet analyserer vi aminosyre mærkning mønstre ved hjælp af GC -MS. Aminosyrer er rigelige på protein og dermed kan fås fra biomasse hydrolyse. Aminosyrer kan derivatized af N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) før GC adskillelse. TBDMS derivatized aminosyrer kan blive splittet på grund af MS og resultere i forskellige arrays af fragmenter. Baseret på massen til at oplade (m / z) forholdet mellem fragmenteret og fragmenteret aminosyrer, kan vi udlede den mulige mærket mønstre af de centrale metabolitter, der erforløbere for de aminosyrer. tredje, vi spore 13C kulstof overgange i det foreslåede veje, og baseret på isotopomer data, bekræfte, om disse veje er aktive 2. Måling af aminosyrer giver isotopiske mærkning oplysninger omkring otte afgørende forløber metabolitter i det centrale stofskifte. Disse metaboliske centrale knudepunkter kan afspejle de funktioner af associerede central-veje.
13 C-assisteret stofskifte analyse via proteinogene aminosyrer kan anvendes bredt til funktionel karakterisering af dårligt karakteriseret mikrobielle metabolisme 1. I denne protokol, vil vi bruge Cyanothece 51142 som den model stammen til at demonstrere brugen af mærket kulstof substrater for at opdage nye enzymatiske funktioner.
Protocol
Discussion
Denne protokol består af fodring cellen med en mærket substrat og måle den resulterende isotopisk mærkning mønstre i de aminosyrer via GC-MS. Siden MS data (m / z nøgletal) giver blot det samlede beløb for mærkning af MS ioner, er vi nødt til at vurdere isotopomer fordelinger af aminosyrer ved at undersøge m / z forhold for både fragmenteret (M-57) + og fragmenteret aminosyrer (dvs. (M-159) + og (f302) +). Desuden kan vi udføre flere cellekulturer med en kemisk identisk mediu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en NSF Career Grant (MCB0954016) og en DOE Bioenergi Research Grant (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
Referências
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
