מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic
Summary
13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.
Abstract
חיידקים יש מסלולים מטבוליים מורכבים שניתן לחקור בשיטות הגנומיקה ביוכימיה תפקודית. אחת הטכניקות חשוב לבחון מטבוליזם התא המרכזי לגלות אנזימים חדשים היא 13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים 1. טכניקה זו מבוססת על תיוג איזוטופי, לפיה חיידקים ניזונים עם 13 ג שכותרתו מצעים. על ידי התחקות את המעבר בין הנתיבים אטום מטבוליטים ברשת ביוכימיים, אנו יכולים לקבוע מסלולים פונקציונלי לגלות אנזימים חדשים.
כפי שיטת משלים transcriptomics ו proteomics, גישות לניתוח isotopomer בסיוע של מסלולים מטבוליים מכילים שלושה שלבים עיקריים 2. ראשית, אנו לגדל תאים עם 13 ג שכותרתו מצעים. בשלב זה, את ההרכב של המדיום ואת הבחירה של מצעים שכותרתו הם שני גורמים מרכזיים. כדי למנוע רעשים מדידת פחמן הלא מסומן תוספי תזונה, מדיום מינימלי עם מקור הפחמן היחידי הנדרש. יתר על כן, הבחירה של מצע שכותרתו מבוססת על כמה יעיל זה יהיה להבהיר את מסלול להיות מנותח. בגלל האנזימים רומן לעתים קרובות כרוך stereochemistry תגובה אחרת או מוצרי ביניים, באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם אינפורמטיבי יותר לאיתור מסלולים רומן מאלה שכותרתו אחיד לגילוי מסלולים הרומן 3, 4. שנית, אנו מנתחים את דפוסי חומצה אמינית תיוג באמצעות GC -MS. חומצות אמינו הן בשפע חלבון ולכן ניתן להשיג הידרוליזה ביומסה. חומצות אמינו ניתן derivatized על ידי N-(טרט-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) לפני ההפרדה GC. חומצות אמינו TBDMS derivatized יכול להיות מקוטעת על ידי MS והתוצאה במערכים שונים של שברים. בהתבסס על מסת יחס תשלום (m / z) של חומצות אמינו מקוטעת unfragmented, אנו יכולים להסיק את דפוסי שכותרתו אפשרית של מטבוליטים מרכזי, כי הםסימנים מקדימים של חומצות אמינו. שלישית, אנו מעברים עקבות הפחמן 13C את המסלולים המוצעים, בהתבסס על הנתונים isotopomer, לאשר מסלולים אלה הם 2 פעילים. מדידה של חומצות אמינו מספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר חיוני במטבוליזם המרכזי. אלה צמתים מרכזיים מטבולית יכול לשקף את הפונקציות של מסלולים מרכזיים הקשורים.
13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים באמצעות חומצות אמינו proteinogenic יכול להיות בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי של חילוף החומרים של חיידקים גרוע מאופיינים 1. בפרוטוקול זה, נשתמש Cyanothece 51142 כמו מאמץ את המודל להדגים את השימוש מצעים פחמן שכותרתו לגילוי פונקציות האנזימטית חדש.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה כולל האכלה את התא עם המצע שכותרתו למדידת דפוסי כתוצאה תיוג איזוטופי של חומצות אמינו באמצעות GC-MS. מאז MS הנתונים (m / z יחסי) לתת בדיוק את הכמות הכוללת של תיוג של יונים MS, אנחנו צריכים להעריך את הפצות isotopomer של חומצות אמינו על ידי בחינת מ '/ z יחס של שני unfragmented (M-57…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק קריירה NSF (MCB0954016) לבין מחקר Bioenergy DOE גרנט (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
Referências
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
