تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.
العديد من الأمراض المدمرة الموروثة العين ينتج العمى التدريجي الذي لا رجعة فيه لأن البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المريضة أو الموت في شبكية العين. في المقابل ، فإن الشبكية الزرد أخلاقي قوي يمتلك القدرة على التجدد تلقائيا أي فئة العصبية التي فقدت في مجموعة متنوعة من نماذج مختلفة لتلف شبكية العين ، بما في ذلك ثقب في شبكية العين ، التذرية الكيميائية ، وارتفاع في درجة الحرارة المركزة ، والعلاج المكثف ضوء 1-8. مختبرنا تميزت على نطاق واسع من التجديد المستمر مبصرات التالية العلاج المكثف ضوء في شبكية العين والخلايا العصبية الداخلية بعد intravitreal ouabain حقن 2 ، 5 ، 9. في جميع الحالات ، المقيم الدبقية مولر إعادة إدخال دورة الخلية لانتاج الخلايا العصبية الأسلاف ، التي ما زالت تتكاثر وتهاجر إلى طبقة الشبكية سليمة ، حيث تفرق في الخلايا العصبية ناقصة.
تتميز نحن خمس مراحل مختلفة خلال تجديد داما الخفيفGED الشبكية التي أبرزها استجابات الخلايا المحددة. حددنا عدة جينات وأعرب تفاضلي في كل مرحلة من التجدد في شبكية العين عن طريق التحليل ميكروأري مرنا 10. كثير من هذه الجينات هي أيضا حاسمة بالنسبة للتنمية العين. لاختبار دور كل الجينات مرشح / البروتين خلال تجديد شبكية العين ، نحن في حاجة إلى تطوير طريقة للحد من التعبير مشروط من البروتين المرشح الوحيد في بعض الأحيان خلال التجديد للشبكية الكبار.
وتستخدم على نطاق واسع لدراسة oligos Morpholino فقدان وظائف بروتينات معينة أثناء وضع الزرد ، القيطم والحمص ، والماوس ، والاورام في 11-14 xenografts الإنسان. هذه basepair oligos تعديل تسلسل الحمض النووي الريبي مع مكملة لكتلة إما الربط أو الترجمة من الحمض النووي الريبي الهدف. Morpholinos مستقرة في الخلية ، ويمكن القضاء عليها أو التعبير "ضربة قاضية" البروتين لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام 12.
هنا ،وصفنا أسلوبا لاستهداف التعبير بكفاءة ضربة قاضية البروتين في شبكية العين الزرد الكبار. هذا الأسلوب يستخدم lissamine الموسومة morpholinos العقاقير التي يتم حقنها في الجسم الزجاجي للعين الزرد الكبار. باستخدام الملقط الكهربائي ، ثم هو electroporated morpholino في جميع أنواع الخلايا في شبكية العين الظهرية والمركزية. Lissamine يوفر هذا الاتهام على لmorpholino electroporation ويمكن تصور لتقييم وجود morpholino في خلايا الشبكية.
يمكن أن تستخدم ضربة قاضية الشرطية في شبكية العين لدراسة دور بروتينات معينة في أوقات مختلفة خلال التجدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة دور بروتينات معينة في الشبكية سليمة ، في عمليات مثل تنبيغ البصرية وتجهيز الخلايا العصبية البصرية في الدرجة الثانية.
مؤخرا ، بحثت تحليلين ميكروأري التغييرات التعبير الجيني التي حدثت خلال تجديد إما شبكية العين للضوء تلف أو تصحيحا جراحيا ، يستأصل الشبكية 10 و 16. وكشفت دراسات كلا الجينات العديدة التي عرضت تغييرات كبيرة في التعبير ، وإما زيادة أو النقصان ، يرجح أن تكون مطلوبة من أجل الأحداث المختلفة التي تحدث أثناء تجديد شبكية العين ، مثل رجوعها من الدبقية مولر في دورة الخلية ، واصلت الانتشار وهجرة أسلاف الخلايا العصبية في طبقة الشبكية التالفة ، والتفريق بين الأسلاف العصبية إلى نوع من الخلايا العصبية الصحيحة. في حين أن المقارنة المباشرة لهاتين المجموعتين البيانات ميكروأري تكشف الجينات المرشحة التي قد تكون ضالعة في هذه الأحداث الخلوية ، في نهاية المطاف يجب أن يكون اختبار هذه الجينات والبروتينات التي ترميز لتحديد ما إذا كانت ضرورية لتجديد الخلايا العصبية. هنا ، نحن تصف خسارة قوية من وظيفة إلى نهج conditioالبروتينات ضربة قاضية نالي الفائدة في شبكية العين الزرد الكبار. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة كل من البروتينات داخل الخلايا وخارج الخلية ، وكذلك جزيئات الإشارة ، عوامل النسخ والبروتينات اللازمة لتكرار الحمض النووي 17-19. وهكذا ، ساعد هذا الأسلوب إلى حد كبير فهمنا للآلية الجزيئية الكامنة وراء الشبكية التجدد الكبار في الزرد.
نحن اختبار المعلمات electroporation متعددة (الجهد ، وعدد من البقول ، والوقت بين البقول) قبل التوصل إلى بروتوكول ناجحة. يستخدم التقرير السابق للelectroporating morpholinos في الزعنفة الذيلية الزرد تجديد 10 نبضات في الجهد المنخفض (15 V) 20. لأن حاصرت الشبكية الزرد الكبار بحلول طبقات خلايا متعددة وغير قابل للوصول بسهولة إلى أقطاب منتاش ، كانت المعايير المستخدمة في زعنفة ناجحة في electroporating بكفاءة morpholinos الكبار في شبكية العين. في المقابل ، فان الجهد العالي (100 V) الدقة في كثير من الأحيانulted في الموت للأسماك. مؤخرا ، 5 البقول من 80 وصفت الخامس لelectroporate DNA البلازميد في شبكية العين الماوس الجرو الوليد 21. وجدنا أن أقل قليلا مكثفة 2 البقول من 75 V أسفرت electroporation الناجح لmorpholinos في شبكية العين الزرد الكبار مع بقاء 100 ٪ من الأسماك المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أن إزالة معظم الخارجي (أو الخارجي الأكثر) المكون من القرنية إلى زيادة كبيرة في كفاءة electroporation. وقد تزايد عدد نبضات قضاء على الحاجة لإزالة هذا النسيج لكنها قد تتسبب أيضا في زيادة تلف الأنسجة. دراسات مراقبة واسعة النطاق أثبتت أن هذه المعايير لم يسبب أي موت الخلايا الشبكية كبيرة أو تغيير استجابات محددة الخلوية التي لوحظت خلال 19 التجدد مبصرة. مكسب من بين الدراسات وظيفة لا يمكن حاليا استخدام هذه التقنية في الجسم الحي ، وذلك بسبب عدم قدرتنا على الدوام electroporate الأحماض النووي الريبي كبيرة في جميع صetinal الخلايا. ومع ذلك ، فإن نجاح electroporating البلازميدات في شبكية العين الماوس في الجسم الحي والزرد في شبكية العين explants يوحي بأنه لا يزال هناك احتمال في الزرد 21 و 22.
واحدة من نقاط القوة في هذه التقنية هو electroporation يبدو أن أعرض morpholino بكفاءة في جميع أنواع الخلايا الشبكية المختلفة. ومع ذلك ، كان واحدا الضعف المحتملة التي electroporation تسليمها بكفاءة morpholino في المناطق الوحيدة التي الشبكية الظهرية والمركزية. حدث electroporation الثانية في اتجاه النصف البطنية من شبكية العين في استهداف النتائج الجيدة لجميع الطبقات ، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الضرر. هذا التقييد المكاني ربما كان ذلك بسبب الشكل والموضع من الأقطاب الكهربائية. قد استخدام أقطاب كوب مصمم خصيصا على شكل يمكن أن توضع حول العين في تحسين هذا الضعف. هذا التقييد المكاني للتسليم morpholino يحد من استخدام هذه التقنية ، ويحول دون استخدام للمقايسة يمثح وتحليل ERG التي تتطلب إجراء تقييم عالمي للشبكية. وتجدر الإشارة إلى أنه كما هو الحال مع أي تجربة morpholino ، فإنه من المستحسن لتأكيد النتائج الخاص به ثانية ، وعدم التداخل morpholino مرنا إلى الهدف. في بعض الحالات ، فمن الممكن أيضا اثنين من electroporate morpholinos مختلفة في نفس الوقت ضربة قاضية إلى التعبير عن اثنين من البروتينات المختلفة. أثبتنا ذلك من خلال اسقاط التعبير عن Pax6a على حد سواء والبروتينات Pax6b ، منفردة ومجتمعة 18.
على الرغم من أننا أظهر استخدام هذه التقنية مع نموذجنا الأضرار الخفيفة يمكن ، من المحتمل أن تستخدم لدراسة تجديد في النماذج أو غيرها من الأضرار 2-8 تستخدم لفحص وظيفة من البروتينات الموجودة في الشبكية التالفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تستخدم من electroporation morpholinos ضربة قاضية إلى التعبير عن قنوات محددة أو الجزيئات نقل الإشارة في العقدة أو خلايا عديم الاستطالات ودراسة ثم وظيفة هذه الإشاراتمسارات في معالجة بصرية. لكن ، وكما morpholinos تؤثر فقط على الترجمة من البروتين الجديد ، فإن المرء لابد أن ينتظر حتى الذاتية دوران البروتين يحدث قبل أن يتم تنفيذ الفحص. اعتمادا على الاستقرار من البروتين ، يمكن أن تتراوح من ساعة إلى 18 يوما.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الحياة Freimann مركز العلوم ومركز البحوث للموظفين اسماك الزرد لرعايتهم والحفاظ على الزرد.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |