表型分析和分离小鼠造血干细胞和传承的承诺祖
Summary
描述的方法来分析流式细胞仪检测骨髓造血祖细胞的分布以及有效地隔离高度纯化造血干细胞（HSCs）。基本上是基于C-kit +细胞和排序，以净化造血干细胞和分子生物学研究细胞的磁富集分离过程。
Abstract
骨髓造血干细胞和更成熟的血细胞谱系祖居住在成年生物体和分化的主要站点。造血干细胞构成的多能干细胞能够产生所有的血细胞谱系的生命时间1分钟的细胞群。在骨髓中的造血干细胞稳态的分子解剖，具有造血，肿瘤学和再生医学的重要意义。我们描述了荧光抗体和流式细胞仪，以取得造血祖细胞亚群及个别小鼠造血干细胞的分布（ 图1）在电子门控过程的标签协议。此外，我们描述了一个方法，广泛丰富造血祖细胞，以及长期（LT）和短期（ST）的重组细胞表达c-kit的磁富集的造血干细胞从汇集的骨髓细胞悬液。由此产生的细胞制剂可用于选定的子集，并在体外进行排序在体内的功能性研究（ 图2）。
2,3都小梁成骨细胞和肝窦内皮细胞4构成支持骨髓中的造血干细胞的功能龛。几个机制中的成骨细胞的利基，包括N-cadherin的成骨细胞3子集和Tie2的表达及其配体血管生成素1 5造血干细胞的受体酪氨酸激酶的相互作用同意确定造血平静。在骨髓中的“休眠”是至关重要的，以保护造血干细胞复制和最终用尽后，过多的骑自行车活动6。外源性刺激作用于细胞的先天免疫系统，如Toll样受体配体7和α-干扰素6也将沿袭承诺祖细胞诱导的造血干细胞的增殖和分化。最近，林内的人口处于休眠状态的小鼠造血干细胞– C-KIT + SCA-1 + CD 150 + CD48 – CD34 –人口已8。细胞排序从此处所述的造血祖细胞富集的细胞悬液，CD34的表达，可以隔离两个静态的自我更新的LT-HSCs和ST-造血干细胞9。一个类似的过程基于血统阳性细胞的枯竭和LT-HSC的排序与CD48和Flk2抗体的先前已描述10。在本报告中，我们提供了一个协议表型特征和体外造血祖细胞，它可以用于监测在不同的生理和病理条件下的造血细胞周期分析。此外，我们描述了流式细胞仪分选造血干细胞的过程，它可以用来定义调节他们的自我更新，在细胞生物学和信号转导检测，以及用于移植的扩张和分化的因素和机制。
Protocol
Discussion
这里介绍的方法能够快速，准确的分析（ 图1）个别小鼠造血。在分析各种实验设置，包括小鼠模型炎症，自身免疫性疾病，免疫缺陷，退行性疾病，代谢性疾病和癌症，允许解决的病理条件下对造血功能的影响。 图3显示了电子门李嘉诚分析细胞周期活动 CD34 –从健康小鼠的细胞和小鼠炎症性肠病（IBD）的13 Ki-67的人与生物圈计划和DAPI染色。后者…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢，仁泷泽伸之Onai和Markus曼茨宝贵意见。这项工作是由瑞士国家科学基金会，瑞士癌症联盟的Fondazione Ticinese每找实习SUL Cancro。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referências
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