المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم
Summary
تم وصف طريقة لتحليل التوزيع من الأسلاف نخاع العظام المكونة للدم في التدفق الخلوي، وكذلك لعزل بكفاءة عالي النقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). ويستند أساسا لإجراء العزل في تخصيب المغناطيسي للخلايا + C-كيت والخلية فرز لتنقية HSCs للدراسات الخلوية والجزيئية.
Abstract
نخاع العظام هو الموقع الرئيسي حيث HSCs وأكثر نضجا الأسلاف نسب خلايا الدم الموجودة وتفرق في كائن بالغ. HSCs يشكل سكان الخلية الدقيقة من الخلايا المحفزة قادرة على توليد خلايا الدم كل الأنساب لبعض الوقت والحياة 1. تشريح الجزيئي للتوازن HSCs في نخاع العظم لديها آثار مهمة في تكون الدم والأورام والطب التجديدي. وصفنا للبروتوكول وضع العلامات مع الأجسام المضادة فلوري والإجراءات المعزولة الإلكترونية في التدفق الخلوي ليسجل فرعية السلف المكونة للدم وتوزيع HSCs في الفئران الفردية (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة لتخصيب على نطاق واسع الأسلاف المكونة للدم، وكذلك على المدى الطويل (LT) وعلى المدى القصير (ST) إعادة تشكيل HSCs من تجميع المعلقات العظام خلية نخاع بواسطة التخصيب المغناطيسي للخلايا التعبير عن C-كيت. يمكن استخدامها في إعداد الخلية الناتجة لفرز فرعية المختارة لفي المختبر، وفي الدراسات المجراة وظيفي (الشكل 2).
كلا بانيات التربيقية 2،3 و 4 جيبية البطانة تشكل منافذ وظيفية دعم HSCs في نخاع العظام. عدة آليات في محراب بانية للعظم، بما في ذلك مجموعة فرعية من الخلايا بانية العظم + N-كادهيرين (3) والتفاعل بين مستقبلات التيروزين كيناز Tie2 أعرب في HSCs مع angiopoietin-1 يجند 5 منه نتفق في تحديد HSCs السكون. "السبات" في نخاع العظام أمر بالغ الأهمية لحماية HSCs من التكرار والإرهاق في نهاية المطاف على النشاط المفرط للدراجات 6. يمكن للمنبهات الخارجية تعمل على خلايا نظام المناعة الفطرية مثل يغاندس مستقبلات على الرقم (7) ومثل انترفيرون-α 6 تحفز أيضا الانتشار وتمايز HSCs إلى الأسلاف الملتزم النسب. مؤخرا، يبلغ عدد سكانها HSCs الماوس نائمة داخل لين – C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 + CD150 + CD48 – CD34 – وصفت سكان 8. فرز الخلايا استنادا CD34 التعبير عن تعليق الخلية المكونة للدم الأسلاف التخصيب كما هو موضح هنا يسمح للعزلة هادئة على حد سواء الذاتي تجديد LT-HSCs وST-HSCs 9. وقد تم إجراء مماثل على أساس استنفاد الخلايا إيجابية نسب والفرز من LT-شهادة الثانوية العامة مع CD48 و Flk2 الأجسام المضادة التي سبق وصفها 10. في هذا التقرير نقدم بروتوكول للتوصيف المظهري والسابقين تحليل دورة الخلية الحية من أسلاف المكونة للدم، والتي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تكون الدم في مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف FACS الفرز الداخلي لHSCs، والتي يمكن استخدامها لتحديد العوامل والآليات التي تنظم احترامهن لتجديد وتوسيع والتمايز في بيولوجيا الخلية والمقايسات نقل الإشارة، وكذلك للزرع.
Protocol
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يمكن تحليل سريع ودقيق من تكون الدم في الفئران الفردية (الشكل 1). هذا التحليل في إعدادات التجريبية المختلفة، بما في ذلك نماذج الفئران من الالتهاب، والمناعة الذاتية، نقص المناعة، والأمراض التنكسية، واضطرابات الأيض والسرطان، ويتيح معالجة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر نوبويوكي Onai، تاكيزاوا هيتوشي ومانز ماركوس للحصول على المشورة الثمينة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل العلم السويسري مؤسسة وطنية، السويسري دوري السرطان وFondazione Ticinese في لوس انجليس من Ricerca Cancro سول.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referências
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
