Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder
Summary
En metod för att analysera fördelningen av benmärgsceller hematopoietiska progenitorer i flödescytometri samt att effektivt isolera höggradigt renade hematopoietiska stamceller (HSC: er) beskrivs. Isoleringen Förfarandet är i huvudsak baserad på magnetiska anrikning av c-Kit + celler och cell sortering för att rena HSC för cellulära och molekylära studier.
Abstract
Benmärgen är den viktigaste platsen där HSC och mer mogna blodkroppar härstamning progenitorer bor och differentierar i en vuxen organism. HSC utgör en minut cellpopulation av pluripotenta celler med förmåga att generera alla blodcellinjer under en livstid 1. Den molekylära dissektion av HSC homeostas i benmärgen har viktiga följder i blodbildningen, onkologi och regenerativ medicin. Vi beskriver märkningen protokollet med fluorescerande antikroppar och den elektroniska gating förfarandet i flödescytometri att göra mål hematopoetiska progenitorceller delmängder och HSC distribution i enskilda möss (Fig. 1). Dessutom beskriver vi en metod för att omfattande berika hematopoetiska progenitorceller och lång sikt (LT) och kortsiktiga (ST) rekonstituering HSC från poolade celler från benmärg suspensioner genom magnetisk anrikning av celler som uttrycker c-Kit. Den resulterande cellen preparatet kan användas för att sortera valda underuppsättningar för in vitro-ochin vivo funktionella studier (fig. 2).
Båda trabekulära osteoblaster 2,3 och sinusformad endotelet 4 utgör funktionella nischer stöd HSC i benmärgen. Flera mekanismer i den osteoblastiska nisch, inklusive en deluppsättning av N-cadherin + osteoblaster 3 och interaktion av receptorn tyrosinkinas Tie2 uttryckt i HSC: er med dess ligand angiopoietin-1 5 sammanfaller vid bestämning HSC: er vila. "Viloläge" i benmärgen är avgörande för att skydda HSC från replikering och slutligen utmattning efter alltför cykla aktivitet 6. Exogena stimuli som verkar på celler i det medfödda immunförsvaret som Toll-like receptor ligander 7 och interferon-a-6 kan också inducera proliferation och differentiering av HSC i härstamning stamceller. Nyligen en population av vilande mus HSC inom lin – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – befolkningen har beskrivits 8. Sortering av celler baserat på CD34-uttryck från den hematopoetiska progenitorer-anrikade cellsuspension som beskrivits här möjliggör isolering av både vilande självförnyande LT-HSC: er och ST-HSC: er 9. Ett liknande förfarande baserat på förbrukningen av härstamning positiva celler och sortering av LT-HSC med CD48 och Flk2 antikroppar har tidigare beskrivits 10. I denna rapport ger vi ett protokoll för fenotypiska karakterisering och ex vivo cellcykeln analys av hematopoetiska stamceller, vilka kan vara användbara för övervakning hematopoes i olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Dessutom beskriver vi en FACS sortering förfarande för HSC, som kan användas för att definiera faktorer och mekanismer som reglerar deras självförnyelse, expansion och differentiering i cell biologi och signal analyser transduktionsmekanismer samt för transplantation.
Protocol
Discussion
Den metod som beskrivs här möjliggör snabb och noggrann analys av hematopoies i individuella möss (figur 1). Denna analys i olika experimentella inställningar, inklusive musmodeller av inflammation, autoimmunitet, immunbrist, degenerativa sjukdomar, metabola sjukdomar och cancer kan ta itu med konsekvenserna av patologiska tillstånd på blodbildningen. Figur 3 visar analysen av cellcykeln aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 – celler från friska möss …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa och Markus Manz för värdefulla råd. Detta arbete har finansierats av schweiziska National Science Foundation, Schweiz Cancer League och Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referências
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, . Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
