इस रिपोर्ट को जीवित कोशिका इमेजिंग और photobleach तकनीक का उपयोग करने के लिए सतह अभिव्यक्ति, परिवहन रास्ते और exogenously व्यक्त, पीएच के प्रति संवेदनशील GFP टैग न्यूरॉन्स के प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन की तस्करी कैनेटीक्स निर्धारित करने का वर्णन करता है.
Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10.
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10.
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This ‘FRAP-FLIP’ protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.
हम एक अभिनव रणनीति के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी के घटक कल्पना का वर्णन. सितम्बर टैग प्रोटीन के साथ तकनीक photobleaching की मिश्रित दृष्टिकोण चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि घटनाओं मूल्यांकन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है. लगातार वसूली के दौरान flanking क्षेत्रों में झिल्ली प्रोटीन photobleaching, 'FRAP फ्लिप' विधि प्रतिदीप्ति वसूली vesicular तस्करी के योगदान का आकलन है. इस उपन्यास दृष्टिकोण प्रोटीन झिल्ली प्रविष्टि का प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, सक्षम दोनों उप डिब्बों की संख्या और जहां वसूली मनाया जाता है वसूली (ΔF) के आयाम स्थिर अवस्था में निर्धारित किया है. इसके अलावा, फ्लिप के साथ और बिना FRAP की तुलना वसूली के अनुपात पार्श्व प्रसार करने के लिए गणना की जा करने के लिए attributable की अनुमति देता है.
इसके अलावा, एक ही प्रयोग में, गैर – photobleached dendrite flanking photobleached क्षेत्रों को निकट के क्षेत्रों में हो सकता हैगुणात्मक वसूली के दौरान मूल्यांकन, प्रतिदीप्ति इन क्षेत्रों में मनाया नुकसान dendrite की इन गैर photobleached के क्षेत्रों में photobleached रिसेप्टर्स की पार्श्व प्रसार के कारण हो जाएगा.
इस चयनात्मक photobleaching प्रोटोकॉल के रूप में परिभाषित subareas में प्लाज्मा झिल्ली में excocytosis निस्र्पक (उदाहरण के लिए, dendrites या कांटा) या समानांतर FRAP द्वारा आयोजित पार्श्व प्रसार बनाम प्रविष्टि के योगदान का आकलन करने और FRAP सेलुलर तस्करी प्रक्रियाओं की एक किस्म की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है आसन्न dendrites के साथ 'फ्लिप प्रोटोकॉल (3 छवि).
जाहिर है, जबकि विशिष्ट दिशा निर्देशों प्रस्तुत किया गया है, प्रत्येक प्रयोगशाला विशिष्ट नमूनों और उपकरणों के अनुसार इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन की आवश्यकता होगी. महत्वपूर्ण बात है, लागत पर लाभ में सभी सतह रिसेप्टर्स करने के लिए z-अक्ष फोकल हवाई जहाज़ की photobleached, स्वतंत्र है, लेकिन महत्वपूर्ण phototoxic क्षति या गैर विशिष्ट photobleaching के बिना होने की जरूरत है. हमेंनेताओं सावधानी बरतें जब सेल सोम पर अपेक्षाकृत कम पीएच intracellular डिब्बों आम तौर पर इन क्षेत्रों में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम के उच्च प्रतिशत के रूप में इस प्रोटोकॉल का प्रयास करना चाहिए,. इसके अलावा, whilst हम दिखा दिया है कि इस तकनीक में लागू किया जा सकता तरीके बदलता है पर चयनात्मक photobleaching प्रयोगों के शुरू करने से पहले, एक नई सितम्बर टैग निर्माण, हम सलाह है कि टैग रिसेप्टर्स की एक प्रारंभिक लक्षण वर्णन पहले आयोजित किया जाता है एश्बी एट अल द्वारा के रूप में वर्णित 2.
कुल मिलाकर, इस विधि मानक FRAP प्रोटोकॉल का एक शक्तिशाली और बहुमुखी अनुकूलन है, सक्षम प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन घटनाओं के पास वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जाना है.
The authors have nothing to disclose.
हम वेलकम ट्रस्ट और वित्तीय सहायता के लिए ईआरसी के लिए आभारी हैं. IMGG EMBO फैलो है. KLH बीबीएसआरसी वित्त पोषित पीएचडी छात्र है. हम तकनीकी और सेल संस्कृति और रखरखाव और सूक्ष्मदर्शी साथ सहायता के लिए समर्थन डॉ. एंड्रयू Doherty के लिए में फिलिप रुबिन और पैट्रिक Tidball धन्यवाद.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |