Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Summary

Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

Abstract

<p class="jove_content"> Las proteínas de membrana como receptores y canales iónicos someterse a la trata de activos en las neuronas, que son altamente polarizada y compleja morfología. Este tráfico dirigido es de fundamental importancia para proporcionar, mantener o eliminar las proteínas sinápticas.</p><p class="jove_content"> Super-eclíptica pHluorin (SEP) es un derivado sensible al pH de eGFP que ha sido ampliamente utilizado para imágenes de células vivas de las proteínas de la membrana plasmática^1-2. A pH bajo, la protonación de septiembre disminuye la absorción de fotones y elimina emisión de fluorescencia. Como el tráfico de eventos intracelulares más ocurren en los compartimientos con un pH bajo, donde septiembre de fluorescencia se eclipsa, la señal de fluorescencia de SEP-etiquetados proteínas es predominantemente de la membrana plasmática donde el septiembre se expone a un ambiente de pH neutro extracelular. Cuando se ilumina en septiembre de alta intensidad, como cualquier tinte fluorescente, es irreversible fotodañada (photobleached)^3-5. Es importante destacar que, debido a un pH bajo apaga la absorción de fotones, que en la superficie expresada septiembre puede photobleached mientras que septiembre intracelular no se ve afectada por la iluminación de alta intensidad^06.10.</p><p class="jove_content"> FRAP (recuperación después de fluorescencia photobleaching) de la SEP de etiquetado proteínas es una técnica conveniente y eficaz para evaluar la dinámica de proteínas en la membrana plasmática. Cuando las proteínas marcadas con fluorescencia se photobleached en una región de interés (ROI) la recuperación de la fluorescencia se produce debido al movimiento de crudos proteínas septiembre-etiquetados en la región blanqueada. Esto puede ocurrir a través de la difusión lateral y / o de exocitosis de no photobleached receptores suministrado ya sea por<em> Novo</em> Síntesis o reciclaje (ver fig. 1). La fracción de proteína inmóvil y móvil puede ser determinada y la movilidad y la cinética de la fracción difusible puede ser interrogado en condiciones basales y estimuladas tales como la aplicación agonista o estímulos neuronales de activación tales como NMDA o aplicación de KCl^8,10.</p><p class="jove_content"> Se describen las técnicas de photobleaching diseñados para visualizar selectivamente la recuperación de la fluorescencia atribuible a la exocitosis. En pocas palabras, un retorno de la inversión se photobleached una vez como con los protocolos estándar del FRAP, seguido, tras una breve recuperación, por repetitivo blanqueo de las regiones de flanqueo. Este protocolo de "FRAP-FLIP", desarrollado en nuestro laboratorio, se ha utilizado para caracterizar el tráfico del receptor de AMPA en las espinas dendríticas¹⁰, Y es aplicable a una amplia gama de estudios de tráfico para evaluar el tráfico intracelular y la exocitosis.</p>

Protocol

1. Cultivo celular, la transducción viral, y expresión de proteínas Neuronas del hipocampo Cultura de alta densidad de crías de rata embrionarias día 18 (E18) sobre cubreobjetos de vidrio poli-l-lisina para 14-25 días in vitro (DIV). 6-24 horas antes de los experimentos en vivo, las células transducen con virus atenuado Sindbis que contienen la proteína de la membrana de interés, marcada con el pHluorin súper eclíptica (SEP). Añadir el medio pseudovirión que contiene directamente al cubreobjetos que contiene 1 ml de medio condicionado y devuelto a la incubadora cultivo. El título y el tiempo de expresión de la proteína después de la transducción viral variará dependiendo del lote de virus y debe determinarse para cada lote antes de comenzar los experimentos de células vivas. 2. FRAP, FLIP imágenes de células vivas Equipo de puesta a punto Transferir el portaobjetos a la cámara de imágenes de un microscopio Zeiss Axiovert META confocal LSM 510.Para minimizar las fluctuaciones de potencia durante la exploración, asegurar el microscopio se ha encendido, con salida de láser 100%, por lo menos 20 minutos antes de la imagen. Inmediatamente, sustituir el medio de cultivo con pre-calentado (37 ° C) solución de grabación extracelular que contiene 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucosa, 1,5 mM de CaCl 2, 1,5 mM de MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH ajustado a 7,4 con NaOH) y colocar la cámara en la etapa de pre-calentado (37 ° C) de la Zeiss Axiovert. Asegurarse de la osmolaridad de la solución de grabación extracelular se ajusta dentro de 10 mOsM de su medio de cultivo. Siempre que no hay evaporación significativa se produce durante el curso de tiempo de la experiencia, la solución independiente de CO 2 es adecuado para experimentos cortos (<10 horas). la suplementación con 1.2 mm de bicarbonato sodio es recomendable. definición los parámetros captura imágenes en primer lugar, identificar una neurona que expresa pro recombinanteproteína interés y ponerla el foco. un aceite 63x se opuso, adquirir imagen toda célula excitación 488 nm utilizando luz láser baja potencia. para reducir al mínimo photobleaching, utilice velocidad nominal rápida (7-9) píxeles resolución (512-512) mantenimiento escaneo total <1 segundo. seleccione parte dendrita zoom capturar marco contiene retorno inversión (~ 1.5-2.5 x óptico). donde sea posible, asegurar campo visión varios procesos manera las mediciones dendritas referencia puede obtener, determinar si no específica photobleaching debido a adquisición está produciendo. ajuste filtros, estenopeica, análisis ganancia del detector fluorescencia permitir máxima mínima, pero saturación limitada. diámetro agujero alfiler grande, recomienda, maximizar recolección fotones (2μm adecuado espinas ternarios). debe ser lo suficientemente fuerte como detectar pequeños incrementos fluorescencia,de tal muy antes fotoblanqueo superar 10% pixeles saturados. guarde esta configuración utilizará pre-> Figura 1. Esquema de los principios de la FRAP FRAP, FLIP vs protocolos Este esquema ilustra los resultados de un FRAP regular versus un protocolo 'FRAP-FLIP ", utilizando Sep-etiquetados receptores. La recuperación de la fluorescencia en el FRAP tradicional se muestra en el lado izquierdo. La recuperación de medición de fluorescencia en el centro de retorno de la inversión se atribuye a una combinación de laterales de difusión f no photobleached receptores de septiembre de etiquetado de fuera de la ROI photobleached y la inserción de los receptores a través del reciclaje y / o de la exocitosis novo en el eje dendríticas. Por el contrario, la photobleached repetitivo de la ROIs flanqueante se ilustra en el lado derecho, se muestra cómo 'FRAP-FLIP' esta modificación silencios protocolo debido a la difusión lateral de recuperación. Como tal, cualquier recuperación fluorescencia medida se puede atribuir a la inserción directa en el retorno de la inversión. Figura 2.La inserción de septiembre-GluA2 en la membrana plasmática en el eje dendrítica A) Una neurona del hipocampo expresan SEP-GluA2, selectivamente photobleached lo largo de una región de la dendrita. El esquema ilustra la región de dendrita que se ha fotografiado, mientras que el panel superior izquierda destaca la ROIs que han sido seleccionados para photobleaching. La gran área de caja blanca se blanqueó una vez, seguido por repetitivo blanqueo de las regiones de acompañamiento en caja, con la destacada dobles encabezados flechas azules. Este panel muestra la dendrita antes de photobleaching. La flecha roja indica el retorno de la inversión medido, que se muestra en el gran aumento en los paneles inferiores. B) muestra la intensidad de fluorescencia en el retorno de la inversión medido durante el curso del tiempo del experimento, trazada como nivel de gris en el ROI (no normalizado). La flecha negro resaltar el punto de tiempo de la fotoblanquear inicial y flecha verde indica el inicio de la photobleaching repetitivo. Df indica ªe incremento en la fluorescencia observada durante el período de recuperación, debido a la inserción de septiembre-GluA2 en el eje dendrítica. Tras pH bajo y un pH de 7,4 + NH 4 lavados Cl confirmar que la fluorescencia recuperado se refiere a la superficie receptores expresados. Figura 3. Reciclaje y reciclaje de lateral frente a la difusión de la SEP-GluK2 en el eje dendríticas después del tratamiento con cicloheximida A) Una neurona del hipocampo expresan SEP-GluK2, de forma selectiva con el FRAP photobleached paralelo y 'Flip-FRAP "protocolos de recuperación realizados a lo largo de regiones de interés dendríticas por separado. Esta neurona fue sujeto a un tratamiento previo con ciclohexamida, para bloquear la síntesis de proteínas (2 horas a 200 g / ml). El esquema ilustra la región de dendrita que se ha fotografiado, mientras que el panel de la izquierda destacando la ROIs que han sido seleccionados para photobleaching. The gran área de caja blanca se blanqueó una vez, seguido por repetitivo blanqueo de las regiones de acompañamiento en caja, de la dendrita inferior solamente, con la destacada dobles encabezados flechas azules. Este panel muestra las dendritas antes de photobleaching. Las flechas rojas resaltar el rendimiento de la inversión se muestra en una gran ampliación en B) que ilustra la recuperación de la fluorescencia en el FRAP tradicional versus el protocolo del 'FRAP-FLIP. Las comparaciones de los niveles de intensidad de fluorescencia en la última etapa de recuperación (paneles de terceros) muestran la contribución de la difusión lateral y el reciclaje en comparación con el reciclaje solo. C) muestra la intensidad de fluorescencia en el rendimiento de la inversión medido en el transcurso del experimento, trazados como intensidad normalizada valores. La flecha negro resaltar el punto de tiempo de la fotoblanquear inicial y flecha verde indica el inicio de la photobleaching repetitivo. Df rec indica que la recuperación transitoria debido al reciclaje del receptor, determina a partir de la dendrita FRAP / FLIP, mientras que Dfesta mide la contribución de la difusión lateral de septiembre-GluK2 en el eje dendríticas en el 'FRAP sólo "retorno de la inversión. El aumento transitorio es seguido por disminución gradual de la señal, correspondiente a la carrera hacia abajo de los receptores disponibles como resultado de un tratamiento ciclohexamida. El pH posterior baja y pH 7,4 + NH 4 lavados Cl confirmar que la fluorescencia recuperado se refiere a la superficie receptores expresados.

Discussion

Se describe una estrategia innovadora para visualizar los componentes de la trata de plasma proteína de la membrana. El enfoque combinatorio de photobleaching técnicas con la proteína de septiembre de etiquetado permite selectivamente la membrana de plasma los eventos de inserción que deben evaluarse. Gracias a la continua photobleaching las proteínas de la membrana en las regiones flanqueantes durante la recuperación, el método de "FRAP-FLIP 'evalúa la contribución del tráfico vesicular a la recuperación de la fluorescencia. Este enfoque novedoso permite la grabación directa de inserción proteína de la membrana, lo que permite tanto el número de sub-compartimientos donde se observa la recuperación y la amplitud de la recuperación (Df) en el estado estacionario que se determine. Además, la comparación de FRAP con y sin FLIP permite la proporción de recuperación atribuible a la difusión lateral para ser calculado.

Además, en el mismo experimento, las regiones de no-photobleached dendrita adyacente a las regiones que flanquean photobleached puede serevaluación cualitativa durante la recuperación, la pérdida de fluorescencia observado en estas regiones se debe a la difusión lateral de los receptores de photobleached en estos segmentos no photobleached de la dendrita.

Este protocolo selectivo photobleaching puede ser utilizado para investigar una variedad de procesos celulares tales como el tráfico que caracteriza excocytosis en la membrana plasmática en subáreas definidas (por ejemplo, las dendritas o espinas) FRAP o evaluar la contribución de la inserción lateral de frente de difusión mediante la realización de FRAP paralelo y los -FLIP 'protocolos a lo largo de dendritas adyacentes (Fig. 3).

Es evidente que, mientras que las directrices específicas se han presentado, cada laboratorio deberá optimizar los parámetros de imagen de acuerdo a las muestras y equipos específicos. Es importante destacar que todos los receptores de la superficie en el ROI necesitan ser photobleached, independiente del plano focal del eje z, pero sin daño significativo fototóxico o fotoblanqueo no específica. Nosotrosres deben tener precaución cuando se trata de este protocolo en el soma celular, como el alto porcentaje de los compartimentos intracelulares de pH relativamente bajos por lo general resulta en la fluorescencia de fondo de alta en estas regiones. Además, aunque se ha demostrado que esta técnica se puede aplicar de varias formas, antes de comenzar los experimentos selectivos photobleaching en un nuevo septiembre de etiquetado construir, se aconseja que una caracterización inicial de los receptores marcados se llevó a cabo primero, como se ha descrito por Ashby et al ^2.

En general, este método es una adaptación potente y versátil del protocolo estándar de FRAP, lo que permite los eventos de inserción en la membrana plasmática que se evalúan en tiempo casi real.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/