Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Summary

Denna rapport beskriver användningen av levande cell imaging och tekniker photobleach att bestämma ytan uttrycket vägar transport-och kinetik handel med exogent uttryckt, pH-känslig GFP-märkta proteiner vid plasmamembranet av nervceller.

Abstract

<p class="jove_content"> Membranproteiner såsom receptorer och jonkanaler genomgå aktiva handel med neuroner, vilka är starkt polariserad och morfologiskt komplex. Detta riktat handel är av grundläggande betydelse för att leverera, underhålla eller ta bort synaptiska proteiner.</p><p class="jove_content"> Super-ekliptikan pHluorin (SEP) är en pH-känsligt derivat av EGFP som har använts i stor omfattning för levande celler avbildning av plasmamembranproteiner^1-2. Vid lågt pH, minskar protonering av SEP fotonabsorption och eliminerar fluorescensemission. Eftersom de flesta intracellulär transport händelser inträffar i fack med lågt pH, där september fluorescens förmörkade, fluorescenssignalen från SEP-märkta proteiner är övervägande från plasmamembranet där september exponeras för ett neutralt pH extracellulära miljön. Vid belysning med hög intensitet september, precis som alla fluorescerande färgämne är oåterkalleligt fotoskadad (photobleached)^3-5. Viktigt, eftersom lågt pH släcker fotonabsorption uttryckte ytbehandlade september kan photobleached medan intracellulära september är opåverkad av den höga intensiteten belysningen^6-10.</p><p class="jove_content"> FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) SEP-märkta proteiner är en bekväm och kraftfull teknik för att bedöma protein dynamik i plasmamembranet. När fluorescensmärkta proteiner photobleached i ett område av intresse (ROI) återhämtningen i fluorescens inträffar på grund av förflyttning av oblekta SEP-märkta proteiner i blekta regionen. Detta kan ske via lateral diffusion och / eller exocytos av icke-photobleached receptorer levereras antingen<em> De novo</em> Syntes eller återvinning (se figur 1). Den fraktion av orörliga och mobila proteinet kan bestämmas och rörlighet och kinetiken av diffunderbart fraktionen kan förfrågas enligt basala och stimulerade betingelser, såsom agonisten applikation eller neuronala stimuli aktivering såsom NMDA eller KCl ansökan^8,10.</p><p class="jove_content"> Vi beskriver fotoblekningsfrekvenser tekniker som syftar att selektivt visualisera återhämtningen av fluorescens kan hänföras till exocytos. I korthet är en ROI photobleached en gång som med vanliga FRAP protokoll, följt efter en kort återhämtning, med upprepad blekning av de flankerande regionerna. Denna "FRAP-FLIP"-protokoll, som utvecklats i vårt labb, har använts för att karaktärisera AMPA-receptorn handel på Dendritutskotten¹⁰, Och är tillämpbar på ett brett spektrum av handel studier för att utvärdera intracellulär transport och exocytos.</p>

Protocol

1. Cellodling, viral transduktion, och Protein Expression Kultur med hög densitet hippocampala neuroner från embryodag 18 (E18) råttungar på poly-L-lysin-belagda täckglas för 14-25 dagar in vitro (DIV). 6-24 timmar före levande experiment, transducera celler med försvagat sindbisvirus innehåller membranprotein av intresse, märkt med super-ekliptikan pHluorin (SEP). Tillsätt pseudovirion-innehållande mediet direkt på täckglaset innehållande 1 ml av konditionerat medium och återfördes till inkubatorn kulturen. Titern och tid för proteinexpression efter viral transduktion kommer att variera beroende på det virus parti och bör bestämmas för varje sats före påbörjandet levande cell experiment. 2. FRAP-FLIP levande cell imaging Utrustning set-up Överför täckglaset till avbildning kammare i ett Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalmikroskop.För att minimera spänningsvariationer under avbildning, se i mikroskop har slagits på, med 100% laserutskrifter under minst 20 minuter före avbildning. Omedelbart, ersätta odlingsmediet med förvärmd (37 ° C) extracellulär registrering lösning innehållande 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glukos, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH justerat till 7,4 med NaOH) och placera kammaren på förvärmda steg (37 ° C) för Zeiss Axiovert. Säkerställa osmolaritet av den extracellulära inspelning lösningen justeras till inom 10 mOsM din odlingsmedium. Förutsatt att inga betydande avdunstning uppstår under tidsförloppet av experimentet, detta är CO 2 oberoende lösning som är lämplig för korta experiment (<10 timmar). komplettering med 1-2 mm natriumbikarbonat rekommenderas. definiera parametrarna bildbehandling först identifiera en neuron som uttrycker den rekombinanta protein av intresse och få det att fokus. 63x olja invände, skaffa sig bild hela cellen 488 nm excitation laserljus låg lasereffekt. för minimera fotoblekning, använd snabb nominellt varvtal (7-9) upplösning (512-512) hålla totala skanningshastighet <1 sekund. välj del dendrite till bilden zooma fånga ram innehåller roi (~ 1,5-2,5 x optisk zoom). om möjligt, se synfältet flera processer så mätningar från referens dendriter kan erhållas avgöra icke-specifik fotoblekning på grund förvärvet sker. justera filter, hål, detektor vinst maximal fluorescens minimal laserexcitation men begränsad mättnad. stor hål diameter rekommenderas maximera foton samlingen (2 pm är lämplig ryggar ternära). detektorn vinsten skall vara stark nog upptäcka små steg,så de allra första bilderna, före inte komma 10% mättade pixlar. spara denna konfiguration ska användas > Figur 1. Schematisk av huvudmännen i FRAP vs FRAP-flip protokoll här schematiska illustrerar resultaten av en vanlig FRAP jämfört med en "FRAP-flip"-protokollet, med SEP-märkta receptorer. Fluorescens återhämtningen i traditionell FRAP visas på vänster sida. Mätt fluorescens återhämtning i den centrala ROI tillskrivs en kombination av laterala icke photobleached diffusion f september-märkta receptorer utanför photobleached ROI och insättning av receptorer genom återvinning och / eller de novo exocytos i dendritiska axeln. Däremot repetitiva photobleached av kompletterande ROI illustreras i höger sida, visar hur modifierad "FRAP-FLIP" protokollet tystnader återhämtning på grund av lateral diffusion. Som sådan kan varje uppmätt fluorescens återhämtning kan hänföras till direkt införande i ROI. Figur 2.Insättning av SEP-GluA2 i plasmamembranet på den dendritiska skaft A) En hippocampus neuron som uttrycker SEP-GluA2, selektivt photobleached längs en ​​region av dendrit. Den schematiska illustrerar området av dendritliknande som har avbildats, medan den övre vänstra panelen belyser ROI som har valts för fotoblekning. Den stora vita inramade området var blekt en gång, följt av upprepad blekning av de flankerande inramade regionerna markerade med dubbla leds blå pilar. Denna panel visar dendritliknande före fotoblekning. Den röda pilen visar den uppmätta ROI, som visas i hög förstoring i de lägre panelerna. B) visar fluorescensintensiteten i den uppmätta ROI över tidsförloppet för experimentet, plottad som grånivå i ROI (ej normaliserat). Den svarta pilen markerar den tidpunkt av den initiala photobleach och grön pil anger början av den repetitiva fotoblekning. AF indikerar tee ökning i fluorescens observerades under återhämtningsperioden, på grund av insättning av SEP-GluA2 i dendritiska skaft. Efterföljande lågt pH och pH 7,4 + NH 4 Cl tvättar bekräftar att den återvunna fluorescensen avser ytuttryckta receptorer. Figur 3. Återvinning och lateral diffusion vs Återvinning av SEP-GluK2 på dendritiska axeln efter cyklohexamid behandling A) En hippocampus neuron uttrycker SEP-GluK2 selektivt photobleached med parallell FRAP och "FRAP-flip" protokoll för återvinning utföras längs separata dendritiska ROI. Denna neuron var föremål för förbehandling med cyklohexamid, för att blockera proteinsyntes (2 h vid 200 | ig / ml). Den schematiska illustrerar området av dendritliknande som har avbildats, medan den vänstra panelen belyser ROI som har valts för fotoblekning. The stora vita inramade området var blekt en gång, följt av upprepad blekning av de flankerande inramade regionerna i nedre dendritliknande endast markerad med dubbla leds blå pilar. Denna panel visar dendriterna före fotoblekning. Röda pilarna markera ROI som visas i hög förstoring i B) illustrerar fluorescensen återhämtningen i traditionell FRAP kontra "FRAP-FLIP" protokollet. Jämförelser av nivåer av fluorescens-intensiteten i det sena stadiet av återhämtning (tredje panelerna) visar bidraget av diffusion i sidled och återvinning jämfört återvinning enbart. C) visar fluorescensintensiteten i den uppmätta ROI över tidsförloppet för experimentet, plottad som normaliserad intensitet värden. Den svarta pilen markerar den tidpunkt av den initiala photobleach och grön pil anger början av den repetitiva fotoblekning. AF REC indikerar transienta återvändande på grund av receptor återvinning, bestäms från FRAP / FLIP Dendrite när AFdiff mäter bidrag lateral diffusion av SEP-GluK2 i dendritiska axeln i "FRAP bara" ROI. Den övergående ökningen följs av en gradvis nedgång i signal, motsvarande avställning av tillgängliga receptorer som en följd av cyklohexamid behandling. Den efterföljande lågt pH och pH 7,4 + NH 4 Cl tvättar bekräftar att den återvunna fluorescensen avser ytuttryckta receptorer.

Discussion

Vi beskriver en innovativ strategi för att visualisera delar av plasmamembranprotein människohandel. Den kombinatoriska tillvägagångssätt fotoblekning tekniker med SEP-märkt protein gör att selektivt plasmamembran införande händelser som ska bedömas. Genom att kontinuerligt fotoblekning membranproteinerna i flankerande regioner under återhämtningen, bedömer "FRAP-FLIP-metoden bidrag vesikulär människohandel fluorescens återhämtning. Denna nya metod möjliggör direkt inspelning av protein membran insättning, så både antalet underavdelningar där återvinningen observeras och amplituden i återhämtningen (AF) vid steady state skall bestämmas. Vidare medger jämförelse av FRAP med och utan FLIP andelen återhämtningen beror på lateral diffusion beräknas.

Dessutom, i samma experiment, kan regioner av icke-photobleached dendrit intill de flankerande regionerna photobleached varakvalitativt utvärderas under återhämtningen, fluorescensen förlust observerades i dessa regioner kommer att bero på lateral diffusion av photobleached receptorer i dessa icke-photobleached delar av dendritliknande.

Denna selektiva fotoblekning protokollet kan användas för att undersöka en rad olika cellulära människohandel processer såsom karakterisering excocytosis i plasmamembranet i definierade delområdena (till exempel dendriter eller ryggar) eller att bedöma bidrag lateral diffusion vs insättning genom att genomföra parallella FRAP och 'FRAP -flip "protokoll längs intilliggande dendriter (Fig. 3).

Klart, medan särskilda riktlinjer har lagts fram, kommer varje labb att behöva optimera imaging parametrar som enligt särskilda prover och utrustning. Viktigt är att alla ytreceptorer i ROI behöver vara photobleached, oberoende av z-axeln fokalplanet, men utan signifikant fototoxisk skada eller icke-specifik fotoblekning. OssERS bör iaktta försiktighet när man försöker detta protokoll i cellen Soma, som den höga andelen relativt lågt pH intracellulära fack typiskt resulterar i hög bakgrundsfluorescens i dessa regioner. Dessutom samtidigt som vi har visat hur denna teknik kan tillämpas på varierar sätt innan de börjar selektiva fotoblekningsfrekvenser experiment på ett nytt SEP-märkt konstruktion, rekommenderar vi att en första karakterisering av de märkta receptorer först genomförs, som beskrivs av Ashby et al ^2.

Sammantaget är denna metod en kraftfull och mångsidig anpassning av standarden FRAP, vilket möjliggör införande händelser i plasmamembranet som skall utvärderas i nära realtid.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/