Кожа биопсии эксплантата культуры для отвлечения Первичные человеческие фибробласты
Summary
Культуре фибробластов эксплант протокол от человека биопсию кожи удар технически надежной и простой способ для получения клеток кожи в течение 4-8 недель для банковской около 15-20 миллионов клеток на низких проход.
Abstract
Тканей и клеточных линий, полученных от индивидуума с заболеваниями являются идеальными источниками для изучения связанных с болезнью сотовых фенотипы. Пациент полученные фибробласты в этом протоколе были успешно использованы при выводе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для модели болезни 1. Ранние проходы этих фибробласты могут также использоваться для основанных на клетках функциональных анализов для изучения конкретных путей заболевание, механизмы 2 и последующие подходы скрининга препаратов. Преимущество представленных протоколов более ферментативной процедуры являются: 1) воспроизводимость техники из небольшого количества тканей, полученных из пожилых пациентов, например пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, 2) технически простым подходом над более сложной методологии использования ферментативного лечения, а также 3 ) время рассмотрения: этот протокол занимает 15-20 минут и может быть выполнена сразу же после прибытия биопсии. Ферментативный лечение может занять до 4 часов, а есть проблемыизбытком, снижение жизнеспособности клеток и последующего прикрепления клеток, когда не обрабатываются должным образом. Этот протокол описывает Вскрытие и подготовка 4-мм человека биопсию кожи для отвлечения культуры фибробластов и имеет очень высокий показатель, что важно при работе с пациентом полученных образцов ткани. В этой культуре, кератиноциты мигрировать из биопсии ткани в течение первой недели после приготовления. Фибробласты появляются через 7-10 дней после первого вырост кератиноцитов. DMEM высокий сред глюкозы с добавлением 20% FBS способствует росту фибробластов на кератиноциты и фибробласты перерасти кератиноцитов. После 2 пассажа кератиноциты были разбавляют что приведет к возможности относительно однородных культур фибробластов выражающая фибробластов маркером SERPINH1 (HSP-47). Используя этот подход, 15-20 млн. фибробласты могут быть получены в течение 4-8 недель для мобильного банкинга. Вскрытие кожи занимает около 15-20 мин, клетки затем контролировать один раз в деньпод микроскопом, и средств массовой информации меняется каждые 2-3 дня после привязанности и нарост клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью этого протокола относительно чистых культур фибробластов кожи могут быть получены. Фибробласты имеют характерные морфологические особенности удлиненное, веретенообразной клеточных тел, круглой или овальной формы клеточных ядер, и фибробласты растут выровнены и в связках, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Развитие этого протокола было профинансировано Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM, TR1-01246) и Паркинсона Альянса.
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
Referências
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson’s disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson’s Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
