推导人类纤维原细胞的皮肤穿刺活检植文化
Summary
成纤维细胞植体培养协议，从人体皮肤打孔活检是一种技术上的强大和简单的方法来获取皮肤细胞银行约15-20万个细胞在低通道数的4-8周内。
Abstract
组织和细胞系来自个人与疾病的理想来源，以研究疾病相关的细胞表型。已成功应用于病人在本协议中的成纤维细胞在诱导多能干细胞疾病模型的推导。这些成纤维细胞的早期通道也可以用于基于细胞的功能分析研究特定的疾病的途径，机制2和随后的药物筛选方法。超过酶的程序提交的协议的优点1）再现性的技术从来自年龄较大的病人， 例如，患者的影响与帕金森氏病，2）在更具挑战性的的方法在技术上简单的方法使用酶处理的组织的小金额，和3 ）的时间代价：这个协议需要15-20分钟，可以立即进行活检后到达。酶处理可能需要长达4个小时，并有问题过量，降低细胞活力和随后附着的细胞时，没有妥善处理。本协议描述的解剖和准备一个4毫米的推导成纤维细胞培养人体皮肤活检，并具有非常高的成功率，处理病人源性组织样品时，这是非常重要的。在这种文化中，角质形成细胞活检组织内迁移出后的第一周准备。后的第一个产物，角质细胞，成纤维细胞出现7-10天。与20％FBS高糖DMEM培养基，有利于在角质形成细胞和成纤维细胞，成纤维细胞生长长满角质细胞。已稀释后第2代角质形成细胞产生相对均匀的成纤维细胞培养成纤维细胞的标记SERPINH1（HSP-47）表达。使用这种方法，所产生15-20万成纤维细胞可以在4-8周后细胞银行。皮肤剥离大约需要15-20分钟，细胞，然后每天一次监测在显微镜下，和媒体改变附件和细胞的产物，后每隔2-3天。
Protocol
Representative Results
Discussion
这个协议中，可以得到相对纯培养的皮肤成纤维细胞。成纤维细胞特征的形态学特征拉长，纺锤状细胞体，圆形至椭圆形细胞核，和成纤维细胞生长汇合时，对齐和捆绑。媒体支持如角质形成细胞需要额外补充和生长因子的，或有丝分裂活性，而其他的细胞群中，这允许相对较纯的成纤维细胞培养的成纤维细胞的生长。
随后成纤维细胞传代与胰蛋白酶在1:3至1:5的比例?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这个协议是由加州再生医学研究所（CIRM，TR1-01246）和帕金森联盟的发展。
Materials
| Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
| Dissecting microscope | Leica | S6E |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
| Sterile pointed-tip forceps | ||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.
Referências
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson’s disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson’s Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
