O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e<em> In ovo</em> Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.
Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.
Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócio…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
Tweezers | Dumont | AA | |
Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |