ニワトリ胚の網膜におけるOVOエレクトロポレーションに
Summary
このビデオの全体的な目標は、対象と網膜の注入を実行する方法を示すことであると<emOVOで></em>ハンバーガーで、ニワトリ胚の網膜へのDNA / RNAの構造のエレクトロポレーションおよび胚4日目（E4）であるハミルトンのステージ22-23日。この手法は、遺伝子発現、遺伝子調節、ニワトリ網膜の開発の形態変化を研究する非常に便利です。
Abstract
ニワトリ胚網膜は高等脊椎動物の網膜の開発を研究する優れたツールです。ので、大きいサイズと、外部の開発に、それは、組換えDNA / RNA技術を用いたニワトリ胚網膜を操作するために比較的非常に簡単です。胚の網膜へのDNA / RNAの構造のエレクトロポレーションは、網膜の開発時に網膜幹細胞/前駆細胞の遺伝子調節を研究するための大きな利点を持っています。このようなレポーター遺伝子アッセイ、過剰発現、遺伝子等（shRNA）をノックダウンする遺伝子としてアッセイの異なるタイプのエレクトロポレーション技術を用いて行うことができます。このビデオは、対象となる網膜の注入およびOVOエレクトロポレーションのハンバーガーで、ニワトリ胚の網膜に、胚4日目（E4）であるハミルトンのステージ22から23を示しています。マーカーとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドDNAを直接に配信されることにより、ここでは、OVOエレクトロポレーション技術で 、迅速かつ便利を表示ニワトリ胚網膜下腔、網膜幹細胞/前駆細胞によるDNAの取り込みを容易にするために、電気パルスが続く。 E4で網膜注入とエレクトロポレーションの新しいメソッドは、E1.5 2で注入し、エレクトロポレーションの従来の方法では困難であった後半生まれのニューロン1、を含む、すべての網膜細胞の種類、可視化することができます。
Protocol
Discussion
網膜の注入を対象とE4段階での胚の網膜でのOVOエレクトロポレーションでは特に単一細胞レベルでのすべての6つの主要な網膜細胞型を視覚化する能力が得網膜前駆細胞をターゲットにすることができます。OVOエレクトロポレーションでターゲティングHH10（〜E1.5）で眼胞は眼を形成するために開発した細胞をトランスフェクトすることができます。しかし、これら?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼のHDカメラの使用（キャノンVIXIA HFS100）のために氏ヤミンエンベルに感謝します。この作業は脊髄研究（08から3074-SCR-E-0と10から3091-SCR-E-0）、ブッシュ医学研究賞にNIH（EY018738）、ニュージャージー州委員会からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF manufacturing, Savannah, GA | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co. Reno, Nevada | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus, MA | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Zeiss, Germany | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems, Germany | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Zeiss, Germany | Zeiss Axio Imager A1 |
Referências
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
