모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화
Summary
우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.
Abstract
기능성 모터 뉴런으로 배아 줄기 (ES) 세포의 직접 분화는 질병 메커니즘을 공부하는 신약 화합물을 선별, 그러한 척수 근육 위축증 (SMA)과 루게릭병 (같은 운동 신경 세포 질환에 대한 새로운 치료법을 개발 유망 자원을 나타냅니다 ALS). 많은 현재의 프로토콜은 모터 뉴런 1-4로 마우스 배아 줄기 (MES) 세포를 차별화하는 retinoic 산성 (RA)와 소닉 고슴도치 (쉬)의 조합을 사용합니다. 그러나, 모터 뉴런에 MES 세포의 분화 효율은 어느 정도 성공을 만났다있다. 우리는 크게 현재 설립 프로토콜에 비해 분화 효율을 향상시키는 두 단계의 분화 프로토콜 5 개발했습니다. 첫 번째 단계는 머리와 fibroblast의 성장 요인 (FGFs)를 추가하여 neuralization 과정을 강화하는 것입니다. 소량은 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP) 길항제이며 신경 유도에 연루되어neurogenesis와 앞부분은 신경 patterning 6 형성의 결과의 기본 모델 ccording. FGF 신호는 사후 신경 정체성 7-9를 홍보하여 신경 조직 형성을 유도에서 소량으로 synergistically 역할을합니다. 이 단계에서는 MES 세포는 신경 lineages쪽으로 분화를 촉진하기 위해 이틀 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8로 끝났다되었다. 두 번째 단계는 모터 신경 세포 명세를 유도하는 것입니다. 소량 / MES 세포를 노출 FGFs는 모터 신경 세포 생성을 촉진하기 위하여 앞으로 5 일 동안 RA와 쉬 작용제, Smoothened 작용제 (처짐)로 incubated했다. 모터 뉴런으로 혼란의 분화를 모니터링하기 위해, 우리는 모터 신경 세포 특정 발기인 Hb9 1의 제어하에 유전자 변형 마우스를 표현 eGFP에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. 이 강력한 프로토콜을 사용하여, 우리는 ± 분화 효율 0.8 %를 51 달성 (N = 3, P <0.01, 학생의 T-테스트) 5. immunofluorescent의 결과염색법은 GFP + 세포가 운동 신경 세포 특정 마커, 섬-1과 acetyltransferase 콜린을 (채팅) 표현하는 것으로 나타났다. 우리 두 단계의 차별화 프로토콜은 척추 운동 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기위한 효율적인 방법을 제공합니다.
Protocol
Discussion
MES 세포의 품질은 모터 뉴런의 효율적인 생성을위한 가장 중요한 매개 변수입니다. MES 전지는 자발적인 차별을 방지하기 위해 PMEF에서 재배되어야한다. 난생의 추가가 undifferentiated 상태에서 MES 세포를 유지하는 데 도움이됩니다. MES 세포마다 12-15 H를, 분열적으로 문화 매체가 급속히 고갈되고 매일 교체해야합니다.
쉬 경로의 효율적인 활성화 운동 신경 세포 사양을 유발하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 원고는 2011년 5월 26일 일에 돌아가셨 박사 Wenlan 왕의 기억에 전념하고 있습니다. 우리는 넉넉한 본 연구에 사용된 HBG3 MES 세포를 제공해 주셔서 박사 더글러스 A. 커 감사드립니다. 이 작품은 Nemours 추진하는 사업, 연구 자원을위한 국립 센터 (NCRR)을 위해 센터를 지원하는 NCRR에서 코브레 기금 수상 (5 P20 RR020173-05)의 INBRE 프로그램하에 부여 (2 RR016472-10) 어린이, 윌밍턴, 델라웨어, 미국의 알프레드 나 듀폰 병원 소아 연구.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
Referências
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
