Summary
माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग दवा सहिष्णु biofilms रूपों जब कुछ शर्तों में सभ्य. यहाँ हम संवर्धन एम. के लिए विधियों का वर्णन तपेदिक biofilms और दवा सहिष्णु persisters की आवृत्ति का निर्धारण. इन प्रोटोकॉल आगे के अध्ययन के लिए उपयोगी दवा सहिष्णुता में एम. के तंत्र में हो जाएगा तपेदिक.
Protocol
1. एम. की बढ़ रहा है biofilms एक 250ml पेंच छाया बोतल में क्षयरोग
- मीडिया तैयारी: के.एच. 2 4 पीओ, 0.5g MgSO की 4, एल Asparagine के 4g, साइट्रिक एसिड की 2g, Ferric अमोनियम साइट्रेट की 0.05g, पानी की 900mL में ग्लिसरॉल के 60ml की 0.5g भंग. NaOH के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें. आटोक्लेव शांत है, और अभी प्रयोग शुरू करने से पहले, 0.1% w के अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ 4 ZnSO जोड़ें / वी. चूंकि एम सी सात हज़ार 2 एक pantothenate auxotroph के इस तनाव भी अंतिम एकाग्रता की 10μg/mL में pantothenic एसिड की आवश्यकता है.
नोट: यह है Sauton एम. तपेदिक के लिए इस्तेमाल किया मीडिया के एक मानक संरचना है. हालांकि, यदि आवश्यक अन्य विशिष्ट मीडिया भी अन्य माइकोबैक्टीरियल प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Inoculums तैयारी: एम. बढ़ो तपेदिक 7H9OADC में 0.05% एक सप्ताह के लिए बीच 80 या 600 0,7 करने के लिए 1,0 के आयुध डिपो के साथ. घनLTURE सीधे 1:100 कमजोर पड़ने पर inoculum के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक 250ml पेंच छाया polystyrene बोतल (Corning) Sauton मीडिया की 25ml बांटना. मध्यम, टोपी बोतल inoculum का 250μl बहुत कसकर जोड़ें और यह 3 सप्ताह के लिए undisturbed जगह humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में. निरीक्षण बोतल हर दिन में एक बार करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई संदूषण है.
- तीसरे सप्ताह के अंत में, एम. के आगे विकास की अनुमति देने के लिए बोतल टोपी ढीला इंटरफ़ेस में तपेदिक. यदि टोपी इस स्तर पर नहीं ढीला है, तो कंटेनर में अपर्याप्त ऑक्सीजन एकाग्रता जीवाणुओं के आगे विकास धीमा होगा.
2. एम. की वृद्धि 12 अच्छी तरह से प्लेट में तपेदिक biofilms
- 2 एम सी 7000 की मीडिया और inoculum तैयार वर्गों A1 और A2 के में वर्णित के रूप में.
- मीडिया के inoculum का 600μl साथ में 60ml मिश्रण. 4.5m बांटनामिश्रण की प्लेट की हर अच्छी तरह से में एल. ढक्कन के साथ कवर प्लेट. थाली parafilm के साथ कई बार लपेटें. 37 ° सेल्सियस पर 5 हफ्तों के लिए humidified इनक्यूबेटर में undisturbed थाली सेते हैं.
3. एम. में दवा सहिष्णु persisters की आवृत्ति निर्धारण तपेदिक biofilms
- एम. आगे बढ़ें इस अनुभाग बी में वर्णित के रूप में 12 अच्छी तरह प्रारूप में तपेदिक biofilms के बारे में 5 सप्ताह की कुल ले जाएगा.
- एक बार biofilms परिपक्व ऊष्मायन 5 हफ्तों के बाद वांछित एकाग्रता पर biofilms पिपेट में microtip का उपयोग कर नीचे मीडिया में एंटीबायोटिक की अपनी पसंद इंजेक्षन.
नोट: pellicles नीचे 3.0mL के बारे में मीडिया की मात्रा कम कर देता है. तो जांचकर्ताओं के अनुसार दवा की मात्रा की गणना करना चाहिए.
- भंवर थाली धीरे इतना है कि एंटीबायोटिक मध्यम में अच्छी तरह से दूर तक फैला हुआ है. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणामों के लिए, antibi इंजेक्षनचार कुओं में कान का. समानांतर में, विलायक में एक ही मात्रा में एंटीबायोटिक अन्य चार कुओं में भंग कर दिया गया था इंजेक्षन, और अछूता थाली के अंतिम चार कुओं छोड़ के. ढक्कन के साथ कवर थाली और थाली के चारों ओर parafilm की ताजा परत डाल. यह वापस इनक्यूबेटर में वांछित समय अवधि के लिए रखें.
- ऊष्मायन के अंत में, प्लेट खुला और कुओं की प्रत्येक में 0.1% की अंतिम एकाग्रता (मात्रा / मात्रा) के बीच जोड़ने-80. डिटर्जेंट की वर्दी प्रसार के लिए पूरी थाली धीरे ज़ुल्फ़. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए थाली सेते हैं. विंदुक कई बार ताकि संपूर्ण सामग्री समान रूप से एक 15ml चोटीदार ट्यूब के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है के साथ एक अच्छी तरह की सामग्री का मिश्रण.
- नीचे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब की सामग्री स्पिन 4000rpm पर. ताजा धो बफर (पीबीएस साथ 10% ग्लिसरॉल और 0.05% के बीच - 80) की 5ml में गोली Resuspend. धोने में तीन बार दोहराएँ. धो बफर के 5ml के में गोली Resuspend के. झूली कुरसी पर यह ओ के लिए रखें4 में vernight डिग्री सेल्सियस
नोट: हालांकि कम तापमान मूलतः एम. smegmatis (फैलाव के दौरान इसकी वृद्धि को कम करने के लिए) के लिए विकसित किया गया था और एम. के रूप में अच्छी तरह से तपेदिक के लिए प्रयोग किया जाता है, धीमी गति से बढ़ रही प्रजातियों में सबसे अधिक संभावना परिणाम पर कोई प्रभाव के बिना कमरे के तापमान पर कर सकते हैं हिल जा. कमरे के तापमान पर कमाल आवश्यक हो सकता है अगर बीएसएल -3 सुविधा में काम कर सकता है.
- एक बाँझ सिरिंज उपयुक्त आकार करने के लिए अपने व्यापक अंत काटने, यह सिरिंज फिटिंग और यह parafilm साथ लपेटकर द्वारा microtip (2 200μl) के साथ फिट तैयार करते हैं. टिप से सज्जित सिरिंज के माध्यम से ट्यूब की सारी सामग्री दर्रे और एक ताजा 15ml ट्यूबों में एकत्र. इस कदम 5 से 6 बार दोहराएँ जब तक आप एक काफी समरूप निलंबन का निरीक्षण.
- निलंबन और 7H11OADC प्लेट पर dilutions के प्लेट के धारावाहिक dilutions के प्रत्येक अच्छी तरह से आर्थिक रूप से व्यावहारिक कालोनियों की संख्या निर्धारित करने के लिए तैयार. 37 ° सी इनक्यूबेटर में तीन सप्ताह के लिए प्लेटें सेते हैं. Frequen निर्धारितविलायक इलाज प्लेटों पर प्राप्त उन लोगों के लिए इलाज एंटीबायोटिक में प्राप्त कालोनियों की संख्या के अनुपात की गणना से biofilm आबादी में persisters की cy.
4. प्रतिनिधि परिणाम
जब एक बोतल में सभ्य एम. के विकास, तपेदिक के पहले हफ्ते के अंत तक बोतल के आधार पर देखा जा सकता है. दूसरे सप्ताह के अंत तक, हवा मीडिया इंटरफ़ेस पर बैक्टीरिया की बद विकास, देखा जा सकता है हालांकि हवा मीडिया इंटरफ़ेस में वृद्धि लगातार तीसरे सप्ताह (छवि 1 ए) के अंत में दिखाई देता है. इस समय कंटेनर की दीवार के लिए बैक्टीरिया की कुर्की भी मनाया जाता है. इस बिंदु से आगे संस्कृति के विकास मुख्य रूप से हवा मीडिया इंटरफ़ेस पर होता है. सतह वृद्धि के नीचे तरल स्पष्ट है. आमतौर पर, संरचना पांचवें हफ्ते (छवि 1 बी) के अंत तक परिपक्व. यदि ऊष्मायन लंबे समय तक है, संरचनाओं के लिए कंटेनर के नीचे सिंक करने के लिए शुरू हो जाएगा. दिलचस्प,तीसरे सप्ताह के अंत तक टोपी की कस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है, और अज्ञात कारणों के लिए एक बोतल काफी ढीले छाया 9 अंतरफलक पर विकास की दीक्षा retards.
12 अच्छी तरह प्रारूप में, हवा मीडिया इंटरफ़ेस में एक मजबूत biofilm कुओं की प्रत्येक में पांच सप्ताह (चित्र 2A) के अंत में देखा जाता है. अगर प्लेट पूरी तरह से नहीं लिपटे रहे हैं, तो अंतर है biofilm विकास मनाया जाता है. सबसे खराब स्थिति में, महत्वपूर्ण मीडिया वाष्पीकरण जीवाणुओं के विकास को (चित्र 2B) स्टाल कर सकते हैं. इस प्रकार, थाली के रैपिंग के लिए आवश्यक है दोनों वाष्पीकरण को रोकने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से biofilm गठन (पिछले पैराग्राफ देखें) के लिए वातावरण प्रदान करते हैं.
इस तकनीक के साथ निर्धारित biofilms में व्यवहार्य बेसिली की संख्या काफी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. एम. के उत्तर तपेदिक biofilms एंटीबायोटिक दवाओं के प्रकृति के साथ बदलता रहता है. रिफैम्पिसिन के रूप में एक जीवाणुनाशक एंटीबायोटिक के लिए व्यवहार्यता की हानि एक bipha इस प्रकार है प्रवृत्ति वैसा 9. पहले तीन से चार दिन लगातार चरण में जो जनसंख्या का एक छोटा सा प्रतिशत पूरी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के लिए एंटीबायोटिक या जोखिम के समय की एकाग्रता के बिना अड़ियल रहना के बाद के दौरान एक व्यवहार्यता में तेजी से गिरावट आई है. चित्रा 3 7 दिन रिफैम्पिसिन 50μg/mL के लिए जोखिम (50 बार एमआईसी से अधिक) के बाद परिपक्व biofilms में व्यवहार्य बेसिली की संख्या से पता चलता है.
चित्रा 1 ए एम के प्रारंभिक स्वरूप ऊष्मायन के 3 सप्ताह के बाद हवा मीडिया बैक्टीरिया के इंटरफेस पर तपेदिक बेसिली.
चित्रा 1 बी. एम. के biofilms परिपक्व ऊष्मायन के पांच सप्ताह के बाद हवा मीडिया इंटरफ़ेस पर तपेदिक.
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चित्रा 2A एम. के 5 सप्ताह पुराने biofilms तपेदिक 12 अच्छी तरह प्रारूप में वृद्धि हुई है.
चित्रा 2B. एक असफल 12 अच्छी तरह से थाली में parafilm बिना एम. तपेदिक biofilms विकसित करने का प्रयास.
3. प्रतिनिधि एम. दवा सहिष्णु persisters की आवृत्ति दिखा साजिश आंकड़ा तपेदिक 12 अच्छी तरह प्रारूप में हो गई है और सात दिनों के लिए रिफैम्पिसिन की 50μg/mL उजागर biofilms.
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Discussion
तपेदिक (टीबी), माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के संक्रमण की वजह से वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा बनी हुई है. दुनिया की आबादी का लगभग एक तिहाई asymptomatically रोगज़नक़ द्वारा संक्रमित होने का अनुमान है, के बारे में 9 लाख नए मामलों क्लिनिक में हर साल चलता है कि सक्रिय टीबी और संक्रमण के बारे में 1.7 मिलियन हर 11 वर्ष के मरने के लक्षणों के साथ. रोग के भारी बोझ मुख्य रूप से एक टीका और एक अत्यधिक जटिल रसायन चिकित्सा कि एक बहुऔषध छह से नौ महीनों में प्रशासित आहार शामिल की कमी के द्वारा योगदान दिया है. लंबे समय तक कीमोथेरेपी काफी हद तक कि 12 एंटीबायोटिक दवाओं के विस्तारित जोखिम की आवश्यकता है रोगज़नक़ का एक छोटा सा subpopulation की प्ररूपी सहिष्णुता के लिए जिम्मेदार ठहराया है. जबकि इन persisters लक्ष्यीकरण तपेदिक की कमी और प्रभावी उपचार के लिए महत्वपूर्ण है, इन persisters के विकास अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं.
सबसे माइक्रोबियल speciउनके प्राकृतिक निवास स्थान में तों सहज आत्म इकट्ठे हो जाना, सतह संलग्न multicellular समुदायों biofilms, जो अत्यधिक 3 एंटीबायोटिक दवाओं के लिए सहिष्णु हैं कहा जाता है. हाल ही में, यह दिखाया गया है कि कई माइक्रोबैक्टीरियल प्रजातियों, मजबूत biofilms, जो एक microenvironment कि दवा सहिष्णु persisters 9,13-15 के विकास को बढ़ावा देने प्रदान करते हैं के रूप में इन विट्रो में वृद्धि की प्रवृत्ति है. जबकि तेजी से एम. के रूप में पर्यावरण प्रजातियों से बढ़ smegmatis आसानी डिटर्जेंट से मुक्त मीडिया में biofilms फार्म कर सकते हैं, धीमी गति से बढ़ रही रोगजनक एम. प्रजातियों तपेदिक विशिष्ट शर्तों multicellular संरचनाओं 9 फार्म की आवश्यकता है. संवर्धन एम. के बाद से biofilms में तपेदिक दवा सहिष्णुता और दृढ़ता, biofilms में एक खुला स्रोत के माध्यम से रोगज़नक़ तपेदिक अनुसंधान के लिए एक सीमित संसाधन देश में मूल्यवान होगा, विशेष रूप से संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के प्रसार के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैंवाई.
यहाँ हम एम. बढ़ रही है की विधि का वर्णन विस्तार से biofilms में तपेदिक. हम यह भी एक प्रोटोकॉल प्रदान को biofilms को तोड़ने के लिए और जनसंख्या में व्यवहार्य बेसिली की संख्या का निर्धारण. इस तकनीक संस्कृति में दवा सहिष्णु persisters की संख्या का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संवर्धन biofilms में तीन सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) एक उचित डिटर्जेंट मुक्त मीडिया की पसंद, संस्कृति कंटेनर बंद के पहले तीन हफ्तों के दौरान, और बाद ऊष्मायन के लिए खुला कंटेनर. इसके अलावा, एक humidified हालत में कंटेनर रखने के भी 5 सप्ताह ऊष्मायन के दौरान मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. यह काफी के परिणामों के reproducibility प्रभावित कर सकते हैं.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
काम से बाहर स्वास्थ्य और अमेरिकी फेफड़े एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थान से वित्तीय सहायता के साथ किया गया.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
petri dish | VWR international | 25384-342 | |
KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
methanol | JT Baker | 9070-05 | |
10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
parafilm M | VWR international | PM-996 | |
15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
- Saltini, C.
Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006). - Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L.
Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004). - Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005). - Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).