Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme
Summary
Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Biyobozunur nanopartiküller solunum yolu enfeksiyon hastalıklarına karşı yeni aşıların intranazal tasarlanması ve uygulanması için çok yönlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Spesifik olarak, polianhidrid alifatik sebasik asit (SA), aromatik 1,6-bis (p-karboksifenoksi) heksan (CPH), ya da amfifilik 1,8-bis (p-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane oluşan nanoparçacıklar (CPTEG) benzersiz toplu ve yüzey erozyonu kinetik 1,2 gösterilecek ve yavaş yavaş in vivo 3,4,5 fonksiyonel biyomoleküllerin (örneğin, protein antijenleri, immünglobulinler, vb) serbest bırakmak için kullanılabilir. Bu onlara bir aşı dağıtım platformu 6,7,8 için mükemmel bir seçim yapmak, aynı zamanda sahip oldukları içsel adjuvan aktivite nanoparçacıklar.
Burun içi mukozal aşılamayı takiben doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu düzenleyen mekanizmaları aydınlatmak üzere, bir antijen p moleküler ve hücre yanıtları değerlendirilmesi gerekirbağışıklık yanıtı başlatmadan sorumlu alınıyoruz hücreler (APC). Alveoler makrofajların (AMɸ) akciğer parankimi 9,10,11 baskın sırasında dendritik hücreler, hava yollarında yürütülmesi bulunan başlıca APC'ler vardır. AMɸ mikrobiyal patojenler ve hücre artıkları 12,13 akciğerlerinde temizlenmesi son derece verimlidir. Ayrıca, bu hücre tipi bir adaptif bağışıklık yanıtının 9 başlamasında önemli bir ilk adımdır lenf düğümleri için mikrobiyal antijenlerin taşıma değerli bir rol oynar. AMɸ da doğuştan örüntü tanıma ve çöpçü reseptörleri, salgılar pro-enflamatuar mediatörler ve başbakan naif T hücrelerinin 12,14 yüksek seviyelerde ifade. AMɸ (ör., daha az% 80) arasında göreceli olarak saf popülasyonunun, laboratuarda çalışma için akciğer lavaj yoluyla elde edilebilir. AMɸ immün yetenekli hayvanlar hasat Resident encounte olacak makrofajların temsilcisi fenotipi sağlamakin vivo r parçacık tabanlı aşı. Bu yazıda, farelerden alınan hasat ve kültür AMɸ için kullanılan protokolleri tanımlamak ve in vitro polianhidrid nanopartiküller ile tedaviyi takiben makrofajların aktivasyonu fenotipi inceleyin.
Protocol
Discussion
Tek doz rejimleri 5 intranazal uygulandığında polianhidrid nanoparçacık aşı platformları etkinliğini göstermiştir. Bu aşı dağıtım platformu tarafından uyarılan akciğerlerde ikamet fagositik hücre popülasyonlarının aktivasyon Ölçme potansiyel yeteneğinin değerlendirilmesi sonuçta adaptif bağışıklık yanıtları teşvik etmek için izin verir.
Özellikle akciğer lavaj sıvısında makrofaj hasat ve nanopartiküllerin farklı formülasyonları ile onl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar için Iowa State University Akım Sitometri Tesisi mali destek ve Dr Shawn Rigby için ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum Onun uzman teknik yardım.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
Referências
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
