Protease-und Acid-katalysierten Labeling Workflows beschäftigt<sup> 18</sup> O-angereichertem Wasser
Summary
Stabile Isotopenmarkierung Workflows Einsatz<sup> 18</sup> O-angereichertem Wasser (Leo-Workflows) sind vielseitige Werkzeuge zur quantitativen und qualitativen Proteomstudien. In Protease-assisted (Paleo) Workflows,<sup> 18</sup> O-Atome werden durch proteolytische Spaltung und Carboxyl-Sauerstoff-Austausch durch Proteasen vermittelt eingeführt. In der Säure-katalysierten (Aleo) Workflow,<sup> 18</sup> O-Atome durch Carboxyl Sauerstoffaustausch bei niedrigen pH eingeführt.
Abstract
Stabile Isotope sind unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Massenspektrometrie. Historisch gesehen, haben 18 O-stabilen Isotopen wurde ausgiebig genutzt, um die katalytischen Mechanismen von proteolytischen Enzymen 1-3 studieren. Mit dem Aufkommen der Massenspektrometrie basierenden Proteomik ist die enzymatisch-katalysierten Einbau von 18 O-Atomen, die aus stabilen Isotopen angereicherte Wasser zu einem beliebten Methode quantitativ zu vergleichen Proteinexpression Ebenen (Übersichtsartikel von Fenselau und Yao 4, Miyagi und Rao 5 und Ye et al. 6). 18 O-Kennzeichnung stellt eine einfache und preiswerte Alternative zur chemischen (zB iTRAQ, ICAT) und metabolische (zB SILAC) Markierungstechniken 7. Abhängig von der Protease verwendet wird, kann 18 O-Kennzeichnung in der Einarbeitung von bis zu zwei 18 O-Atomen in der C-terminalen Carboxylgruppe der Spaltprodukt 3 führen </sup>. Die Markierungsreaktion kann in zwei unabhängige Prozesse, die Peptidbindungsspaltung und die Carboxyl Sauerstoff Austauschreaktion 8 unterteilen. In unserem Paléo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-angereichertem Wasser) Anpassung der enzymatischen 18 O-Kennzeichnung, verwendeten wir 50% 18 O-angereichertem Wasser Unterscheidungskraft Isotopensignaturen ergeben. In Kombination mit hochauflösende Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight-Tandem-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) können die charakteristischen Isotop Umschläge zu Spaltprodukten mit einem hohen Maß an Spezifität zu identifizieren. Wir haben vorher haben die Paläo-Methodik zur Erfassung und Charakterisierung endogene Proteasen 9 und überwachen proteolytische Reaktionen 10-11. Da Paleo kodiert das Wesen der proteolytischen Spaltung, ist der Versuchsaufbau einfache und biochemische enrichment Schritte von Spaltprodukten umgangen werden kann. Das Paléo-Verfahren kann leicht an (i) Zeitverlauf Experimente, die die Dynamik der proteolytischen Spaltung Reaktionen und (ii) die Analyse der Proteolyse in komplexen biologischen Proben, die physiologischen Bedingungen stellen zu überwachen erweitert werden. Paleo-Zeitverlauf Experimente helfen identifizieren geschwindigkeitsbestimmenden Verarbeitungsschritte und Intermediate in komplexen proteolytischen Stoffwechselweg Reaktionen. Weiterhin erlaubt die Paleo-Reaktion wir proteolytische Enzyme wie die Serinprotease Trypsin, die fähig, ihre Spaltprodukte binden und katalysieren den Einbau eines zweiten 18 O-Atom ist identifizieren. Solche "double-Kennzeichnung" Enzyme können für postdigestion 18 O-Kennzeichnung, bei denen Peptide ausschließlich durch die Carboxyl-Sauerstoff-Austausch sind beschriftet werden. Unsere dritte Strategie erstreckt Kennzeichnung beschäftigt 18 O-angereichertem Wasser über Enzyme und nutzt sauren pH-Bedingungen, um 18 O-stabilen Isotopen Zeichen einzuführenturen in Peptide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch die Kombination von stabilen Isotopenmarkierung und hochauflösende Massenspektrometrie in einer zeitaufgelösten Weise ermöglicht die Paleo-Zeitverlauf-Methode für eine dynamische Analyse der Erzeugung von Peptid-Produkte. Der Assay kann verwendet werden, um stabile isotopenmarkierte Peptide für die quantitative und qualitative Proteomstudien erzeugen und die Kinetiken, mit denen proteotypischen Peptiden erzeugt werden ausgewertet werden. Weiterhin ist Paleo-Zeitverlauf zur proteolytischen Wege unter spezielle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH / NIDCR Stipendium 1R01DE019796 unterstützt.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue number |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents
Referências
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