Flux de travail d'étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche<sup> 18</sup> O enrichi en eau
Summary
Stable workflows marquage isotopique qui emploient<sup> 18</sup> O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo),<sup> 18</sup> Atomes d'oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d'échange d'oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail,<sup> 18</sup> Atomes d'oxygène sont introduits par échange d'oxygène carboxyle à faible pH.
Abstract
Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l'avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l'incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d'oxygène de l'eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d'expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d'un maximum de deux atomes d'oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 </sup>. La réaction de marquage peut être subdivisé en deux processus indépendants, le clivage liaison peptidique et la réaction de l'oxygène carboxyle échange 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l'eau enrichie) l'adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l'eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l'essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l'analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d'identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d'identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l'incorporation d'un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage" enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d'échange d'oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s'étend étiquetage employant 18 O de l'eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.
Protocol
Representative Results
Discussion
En combinant l'étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue number |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents
Referências
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