Istihdam izotop etiketleme iş akışları<sup> 18</sup> O-zenginleştirilmiş su (LEO-iş akışları) nicel ve nitel proteomik çalışmaları için çok yönlü araçlar vardır. (Paleo) proteaz-destekli iş akışlarında,<sup> 18</sup> O-atomları proteazları aracılığıyla proteolitik bölünme ve karboksil oksijen alışverişi reaksiyonlar tarafından tanıtıldı. Asit katalizörlü (aleo) iş akışında<sup> 18</sup> O-atomları düşük pH'da karboksil oksijen alışverişi tarafından tanıtıldı.
Kararlı izotoplar biyolojik kütle spektrometresi için temel araçlardır. Tarihsel olarak, 18 Ey-kararlı izotopu yaygın 1-3 proteolitik enzimlerin katalitik mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik gelişiyle birlikte, istikrarlı izotopik zenginleştirilmiş su 18 O-atomların enzimatik katalize eklenmesi kantitatif protein ekspresyon düzeyleri (Fenselau ve Yao 4, Miyagi ve Rao 5 ve Ye tarafından gözden karşılaştırmak için popüler bir yöntem haline gelmiştir ark. 6). 18 O-etiketleme bir kimyasal için basit ve düşük maliyetli bir alternatif (örneğin iTRAQ, ICAT) ve metabolik (örneğin SILAC) etiketleme teknikleri 7 oluşturmaktadır. Kullanılan proteaz bağlı olarak, 18 O-etiketleme bölünme ürün 3, C-terminal karboksil grubunda, iki 18 O-atomuna kadar birleşme sonuçlanabilir </sup>. Etiketleme Reaksiyon iki bağımsız süreçler, peptid bağı bölünme ve karboksil oksijen değişiminin reaksiyon 8 ayrılabilir. Bizim paleo (p rotease-bir 18 O-zenginleştirilmiş su mploying ssisted l abeling e) enzimatik 18 O-etiketleme adaptasyonu, biz farklı izotop imzaları verim 50% 18 O-zenginleştirilmiş su kullanılmıştır. Yüksek çözünürlüklü ile kombinasyon halinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu zaman-of-flight tandem kütle spektrometresi (MALDI-TOF/TOF MS / MS), karakteristik izotop zarf özgüllük yüksek düzeyde bir bölünme ürünleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz daha önce proteolitik reaksiyonlar 10-11 algılamak ve karakterize endojen proteazlar 9 ve izlemek için paleo-metodolojisi kullanılmıştır. Paleo proteolitik bölünme reaksiyonu özünü kodlar yana, deneysel kurulum basit ve biyokimyasal Enri olduğunuklevaj ürünlerinin chment adımlar atlatılabilir. Paleo-yöntem kolaylıkla proteolitik bölünme reaksiyonların dinamiklerini ve fizyolojik koşulları temsil karmaşık biyolojik örneklerde proteoliz (ii) analizi izlemek (i) zaman ders deneyler kadar uzatılabilir. Paleo-timecourse deneyler karmaşık proteolitik yolağı reaksiyonlarda hız sınırlayıcı işlem adımları ve reaksiyon ara tanımlamak için yardım. Buna ek olarak, reaksiyon paleo-bize bu tür kendi parçalanma ürünleri rebind ve bir ikinci 18 O-atomu ile birleşmesiyle katalize etmek için yeteneğine sahip serin proteaz tripsin gibi proteolitik enzimlerin belirlemesini sağlar. Böyle bir "çift etiketleme" enzim postdigestion 18 peptidler özel olarak karboksil oksijen değişim reaksiyonu ile etiketlenmiş olduğu O-etiketleme için de kullanılabilir. Bizim üçüncü strateji enzimler ötesinde 18 O-zenginleştirilmiş su istihdam etiketleme uzatır ve 18 O-izotop işareti tanıtmak asidik pH koşullarında kullanırpeptidler içine atures.
Izotop etiketleme ve zamana bağımlı bir şekilde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştirerek, Paleo-timecourse yöntemi peptid ürünlerinin nesil dinamik bir analiz sağlar. Tahlil nicel ve nitel proteomikler çalışmalar için kararlı izotopik olarak etiketlenmiş bir peptit üretmek için ve proteotypic peptidler elde edildikleri kinetik değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, Paleo-timecourse spesifik olarak, fizyolojik olarak uygun koşullar altında ex vivo olarak prote…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796 tarafından desteklenmiştir.
Name of material | Company | Catalogue number |
PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
Name of reagent | Company | Catalogue number |
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
Trypsin Gold | Promega | V5280 |
Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents