HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法
Summary
我々は、条件は、次の2つの方法について説明します。<em>トランス</em>-相補性C型肝炎ウイルス（HCV）は、アセンブリとヘテロカリオンの形成に依存している完全なウイルスのライフサイクルの完了。これらの技術は、感染性HCV子孫の生産を妨げる主要な制限因子を発現する細胞系の画面に適しています。
Abstract
C型肝炎ウイルス（HCV）は、ヒトとチンパンジーに制限宿主域を持つ肝炎ウイルスです。 HCV RNAの複製は、人間の非肝臓およびマウス細胞株で観察されているが、効率が非常に低く、HCVレプリコンを使用して、必要な長期的な選定方法については支配的な抗生物質選択マーカー1-5を発現して構築します。 in vitroでの研究で HCVしたがって、ウイルスのライフサイクルのウイルスのエントリと終了を許容するヒト肝癌細胞株に限定されています。狭い種の指向性をHCVsのため、完全なHCV複製サイクル6-8を維持使用可能な免疫小動物モデルは存在しません。マウス由来の例えば、非ヒト細胞中のHCVの非効率的な複製は、おそらく本質的なホストの依存因子および/または制限因子の発現の遺伝的不和合性の欠如によるものである。
我々はHCVの伝播が支配的な制限FAによって抑制されるかどうかを調べた非肝組織から、またはマウスの肝臓細胞株の由来のヒト細胞株のいずれかでctors。この目的のために、我々は、体細胞融合に頼るつの独立した条件付きのトランス相補方法を開発した。両方のケースでは、ウイルス複製サイクルの完了は、ヘテロカリオンでのみ可能です。その結果、感染性のウイルス子孫の de novoの生産を測定することによって決定される成功したトランス相補性は、支配的な制限がないことを示します。
具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を運ぶサブゲノムHCVレプリコンは非常に寛容なヒト肝癌細胞（ホ-7.5細胞）にトランスフェクトした。その後、これらの細胞は共培養し、HCV構造タンパク質コア、エンベロープ1および2（E1、E2）とアクセサリータンパク質P7とNS2を表現する種々のヒトおよびマウス細胞に融合させた。細胞融合は、ポリエチレングリコール（PEG）で処理することにより開始されている限り、文化は、感染性ウイルスのPAを発表受容体に依存する形でナイーブ細胞に感染rticles。
セルのエントリ、RNAの翻訳、複製およびウイルスのアセンブリを含む完全なウイルスのライフサイクル上の支配的な制限の影響を評価するために、我々は、CD81の内因性発現を欠いているヒト肝細胞株（ホ- 7 Lunet N細胞9）を利用したHCVの本質的な侵入因子。異所的に発現CD81の欠如では、これらの細胞は、HCV感染症の10〜本質的に難治性である。重要なのは、共培養し、少なくとも別の重要な細胞侵入因子（すなわち、SR-BI、CLDN1、OCLN）ヒトCD81が不足して発現する細胞と融合させたときにのみ、結果としてヘテロカリオンは、感染症のために必要なHCVエントリー因子の完全なセットを表示します。したがって、主要な制限因子はHCVの複製サイクルの完了を抑制するかどうかを分析するために、我々は、上記のcritを満たすヒトとマウスの原点からの様々な細胞でLunet N個の細胞を融合ERIA。共培養細胞は、プロトタイプの泡沫状ウイルスの変異性の高い融合ウイルスエンベロープタンパク質（PFV 11）でトランスフェクトし、その後、感染性HCV粒子（HCVcc）でチャレンジしたときに、感染性ウイルスの de novo生産が観察された。これは、HCVが成功し、これらの細胞株における主要な制限因子の発現を除外ヘテロカリオンでのレプリケーションサイクルを完了したことを示します。これらの新しい条件付きトランス相補方法は、HCV特有の主要な制限因子の発現のための細胞株および初代培養細胞の大型パネルをスクリーニングに有用であろう。
Protocol
Discussion
我々は、HCVの複製を妨げるドミナントネガティブ制約の分析のために培養細胞におけるヘテロカリオンの形成を誘導する2つのメソッドを紹介します。これらの手順を使用して様々なヒト非肝臓およびマウス肝臓細胞株における支配的な恒常的に発現またはウイルス誘発因子の存在を除外した。制限要因は感染症の子孫のHCVアセンブリと放出を防止する場合、最初のアッセイでは、主に分析し…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、それぞれ、JFH1とJ6CF分離株のTakaji脇田とイェンス·ブフに感謝しています。さらに我々は、チャールズホ-7.5セルのライスと9E10抗体、E2特異的抗体CBH-23のスティーブンFoung、および実験的ウイルス学、有用な提案や議論のためのTwincore学科のすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
Referências
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