Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC
Summary
Se describen dos métodos para la condicional<em> Trans</em>-La complementación de la hepatitis C (VHC) el montaje y la realización del ciclo de vida viral, que se basan en la formación de heterocarión. Estas técnicas son adecuadas para la detección de líneas celulares que expresan los factores dominantes de restricción, lo que impide la producción de progenie infecciosa del VHC.
Abstract
La hepatitis C (VHC) es un virus hepatotropos con una gama de hospedadores limitada a los seres humanos y los chimpancés. Aunque la replicación del ARN VHC se ha observado en humanos líneas celulares no hepáticos y murino, la eficiencia fue muy baja y requeridas a largo plazo utilizando los procedimientos de selección VHC replicón construye expresar dominantes antibióticos seleccionables marcadores 1-5. VHC en la investigación in vitro se limita por tanto a humanos líneas celulares de hepatoma permisivas para la entrada del virus y la finalización del ciclo vital del virus. Debido a AVC tropismo especies de estrecho, no existe un modelo animal pequeño inmunocompetente disponible que sustenta el ciclo completo de replicación del VHC 6-8. La replicación ineficiente del VHC en células no humanas, por ejemplo de origen de ratón es probablemente debido a la falta de incompatibilidad genética de los factores esenciales de acogida de dependencia y / o expresión de los factores de restricción.
Hemos investigado si la propagación del VHC es suprimida por fa restricción dominantectors en cualquiera de las líneas celulares humanas derivadas de tejidos no hepáticos o en líneas celulares de ratón hígado. Para este fin, hemos desarrollado dos independientes condicionales trans-complementación métodos que dependen de la fusión de células somáticas. En ambos casos, la terminación del ciclo de replicación viral sólo es posible en los heterocariones. En consecuencia, el éxito trans-complementación, que se determina midiendo la producción de novo de progenie viral infecciosa, indica la ausencia de restricciones dominantes.
Específicamente, subgenómico replicones HCV que transportan un transgén luciferasa fueron transfectadas en células de hepatoma humano altamente permisivas (Huh-7.5 células). Posteriormente, estas células fueron co-cultivadas y fusionado a diversas células humanas y murinas que expresan las proteínas estructurales del núcleo del VHC, sobres 1 y 2 (E1, E2) y accesorio proteínas p7 y NS2. A condición de que la fusión celular fue iniciada por tratamiento con polietilenglicol (PEG), la cultura liberado infecciosa viral PArtículos que se infectan células de los animales de una manera dependiente del receptor.
Para evaluar la influencia de las restricciones dominantes en el ciclo vital del virus completo incluyendo entrada a la célula, la replicación del ARN de traducción, y el ensamblaje del virus, que se aprovechó de una línea de células del hígado humano (Huh-7 células Lunet N 9), que carece de expresión endógena de CD81, un factor esencial de la entrada del VHC. En ausencia de ectópica expresó CD81, estas células son esencialmente refractario a la infección por HCV 10. Es importante destacar que, cuando se co-cultivaron y se fusionan con las células que expresan CD81 humano, pero la falta al menos otro factor crucial para la entrada de células (es decir, SR-BI, CLDN1, OCLN), sólo los que resulten heterocariones mostrar el conjunto completo de factores de entrada para la infección por VHC necesarias. Por lo tanto, para analizar si los factores dominantes de restricción suprimir la terminación del ciclo de replicación del HCV, que funden Lunet N celdas con varias células de origen humano y de ratón que cumplen la crit anteriormente mencionadoEria. Cuando se co-cultivos de células se transfectaron con un proteína de la envoltura vírica altamente fusogénica mutante del virus espumoso prototipo (PFV 11) y posteriormente desafiados con partículas infecciosas de HCV (HCVcc), de la producción de novo de virus infeccioso se observó. Esto indica que el VHC completó con éxito su ciclo de replicación en heterocariones descartando así la expresión de factores de restricción dominantes en estas líneas celulares. Estos nuevos condicionales trans-complementación métodos serán útiles para examinar un amplio panel de líneas celulares y células primarias para la expresión del VHC factores específicos de restricción dominantes.
Protocol
Discussion
Se presentan dos métodos para inducir la formación heterocarión en células cultivadas para el análisis de las restricciones dominantes negativos que impiden la replicación del HCV. El uso de estos procedimientos se excluyó la presencia de un factor dominante expresa constitutivamente o inducida por virus, en diversas humano no-hígado y en murinos líneas de células hepáticas. El primer ensayo analiza principalmente si los factores de restricción impida la colocación del VHC y la liberación de la progenie in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a Takaji Wakita y Jens Bukh de JFH1 y aislados J6CF, respectivamente. Además agradecemos a Charles Rice de Huh-7.5 células y el anticuerpo 9E10, Steven Foung para el anticuerpo específico de CBH E2-23, y todos los miembros del Departamento de Virología Experimental, Twincore por sus útiles sugerencias y discusiones.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
Referências
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