Summary
我々のプロトコルは、きれいに、簡単にマウスの腎被膜下膵島または細胞を提供するために開発されました。細胞は、腎臓の被膜下に細胞を移植に使用される最終的なチューブのペレットに集中している。このテクニックの使いやすさは、細胞とマウスへのストレスを軽減。
Abstract
我々のプロトコルは、きれいにし、容易に糖尿病や正常マウスの腎臓被膜下に膵島または細胞を提供するために開発されました。我々は、腎被膜下に細胞を移植するために使用される最終的な配信のチューブ（PE50）のペレット状に島や細胞を集中しやすいことがわかった。細胞にまたはマウスへの過度のストレスを軽減しながらこの手法は、速度と使いやすさの両方を提供します。
ローディング：定住、手で選んだもので、島やペレット化した細胞を注意深くP200 pipettemanとストレート、薄肉ピペットチップを用いて1.5 mlのマイクロチューブの底部を吸引している。 PE50チューブの長さは、小さなシリコンのアダプタチューブを使用して、ピペットの先端に取り付けられています。細胞は先端に、静置され、その後、徐々にpipettemanをダイヤルしてPE50チューブに転送されます。細胞はPE50チューブの終わり近くになったら、キンクが行われ、シリコンのアダプターチューブはキンク上に配置される。 PE50チューブを15 mLの入ったコニカルカット5 mLのピペットに転送され、PE50チューブを遠心中にカーリングを防止するために5 mLのピペットの側面にテープで留めています。細胞を1,000 rpmに到達させ、停止されています。
移植：レシピエントマウスは、麻酔剃毛、そしてクリーンアップされます。小切開は、マウスの左脇腹に行われ、腎臓を露出している。腎臓、脂肪、および組織の生理食塩水綿棒と湿った保たれます。 PE50の遠位端は、シリコンのアダプタチューブを使用して、ピペットの先端を含む、ハミルトンねじ駆動の注射器に接続されています。小さな刻み目が大きすぎたり深すぎない、腎臓の右側腹部側で行われます。細胞最寄りのPE50チューブの斜めに終わりが、、慎重にカプセルの下に配置され、チューブは通常の生理食塩水を拭き取りながら、スペースを作るために静かに周りに移動され、乾燥したカプセルが破れやすいこともできます。小さな気泡はゆっくりとシリンジのねじ駆動をダイヤルすることにより、カプセルの下に配信されます。小島は、その後徐々に空気の泡の後ろに配信されます。かつての島が配信されて腎臓の恒常性が維持され、小物を低熱で焼灼されています。腎臓は、空洞に戻されますし、腹膜と皮膚を縫合してステープルされる。マウスはすぐにフルニキシンとブプレノルフィン平方で処理し、加熱パッド上にケージに入れています。
Protocol
移植用膵島の準備（送信）
- 倒立顕微鏡下で、P200 pipetmanと100ミリメートルプレートで培養膵島からストレートピペットチップを使用して手ピック島。
- 各マイクロチューブに時間と転送（〜500膵島/チューブ/マウス）で膵島100を数える。
- 膵島が遠心管の底に沈降することができます。
- ストレート薄肉ピペットチップを使用してP200 pipetman（130ulで設定）に1つの膵島ペレットを描く。
- シリンジチップにシリコンチューブアダプターを置きます。シリコンアダプタにPE50チューブの長さを挿入します。
- 先端の島よりもフードの壁にPE50チューブより高いフードとテープの側面にpipetmanをハング。これは、島がピペットの先端でのみ解決できるようになります。
- ゆっくりpipetmanをダイヤルし、最後から島を追放することに注意しながら、PE50チューブに島を移動することで、PE50チューブに島を転送します。
- PE50チューブの斜めの端にキンクを行います。キンクを維持しながら、pipetmanからシリコンのアダプターチューブを切断し、シリコーンアダプタを使用してキンクを確保する。
- カット5mLのピペットとテープ付き円錐15mLを遠心分離しながらPE50チューブのカールを防止するために5 mLのピペットの側面上にPE50チューブに、、PE50チューブで、よじれシリコンアダプターチューブ側の小島を下に置きます。
- 1000 rpmでにPE50/15mL conicalsを遠心し、遠心分離をオフにしてください。 （一度に10以上の膵島の準備を準備しないでください）。
- チューブを氷上に置きます。
移植のためのマウスの準備
- イソフルランでまたはケタミン/ Xylexene（準備のプロトコルを参照）を有するマウスを麻酔。
- 麻酔薬が影響を取られた後、マウスの左脇腹を削る。
- 綿棒のポビドンヨード綿棒でマウスの皮膚に、中心アウトし、ETOH綿棒で拭き取ってください。
- 左腎を（単に脾臓の右側）を探します。腹膜を露出させる、皮膚に小さな切開を加えます。
- 腎臓を露出腹膜に小さな切開を加えます。切開が小さく保つことは腎臓が発生し、露出維持するのに役立ちます。
- 切開の両側にわずかな圧力を適用し、上げたり、マウスの腎臓を飛び出す。
- 綿棒をチップソーで生理食塩水を適用することにより、腎臓の潤いを保つ。
- 注射器23または25ゲージの針を使用して、腎臓のカプセルにニックネームを作成し、腎臓の右脇腹に小さな傷を作る;深すぎるまたは大きすぎるではない。
膵島の移植
注：マウスが送信のために準備されている間、二人目はハミルトンスクリュードライブ膵島移植の注射器を準備する必要があります。
- チューブのねじれを抑えながらゆっくりとPE50チューブからシリコンのアダプターチューブを取り外します。
- シリコンのアダプターチューブにPE50チューブの反対側の端を置き、"スクリュードライブ"ガラスハミルトンシリンジに接続されているピペットの先端にシリコンのアダプターチューブを置きます。徐々に島々が漏れていないことを確認して、PE50チューブのキンクを離します。
- "ねじ"のメカニズムを使用してPE50チューブの先端にゆっくりと島を進めるが、PE50チューブの島の前に小さな気泡を維持する。
- ニックに慎重に小さなポケットを作り、カプセルの下にPE50チューブをスライドさせ、腎臓で作ら。カプセルを介して腎臓またはパンクチャリングをガウジしないように細心の注意を払ってください。
- それは通常の生理食塩水、ゲンタマイシン浸した綿棒をチップソーでエリアとカプセルの潤いを保つのに役立ちます。ドライカプセルは破れやすいでしょう。
- ゆっくりと休息に移植膵島のための"ポケット"を作成し、あらゆる方向にチューブを移動します。地域の潤いを保つために追加の生理食塩水を再適用することを忘れないでください。
- マウスを開いていると誰が腎臓被膜下にPE50チューブを配置した人の指導の下で、マウスとハミルトンの移植の注射器を準備二人称は、、ゆっくりと"ポケット"の内部に、カプセルの下に膵島を進めてまいります、すべての膵島を移植されるまで、PE50チューブで配信小気泡の背後にある。
- 徐々に、PE50チューブを取り外し、乾いた綿棒を使用して領域を乾かし、慎重に、低熱でニックネームを焼灼する。
- 乾いた綿棒をチップソーを使用して、すべての出血が停止していることを確認してください。出血が停止したら、滅菌生理食塩水で腎臓を再度湿らせ、ゆっくりと縫合し、皮膚ステープルでマウスを閉じる前に腹膜に腎臓を交換してください。
閉会/マウスのリバイバル
- 5から0絹縫合糸のW / C - 6 19ミリメートル針を用いてランニングステッチで腹膜を閉じます。
- 使用して鉗子は、一緒に皮膚切開の両側面を描く。
- 2つまたは3つのステープルと一緒に皮膚ステープル。
- 綿棒とサリンをチップソーを使用して、任意の血液のマウスの皮膚をきれいにE.
- すぐにフルニキシンとブプレノルフィンの皮下注射でマウスを扱う。
- マウスが完全にアクティブになるまで、加熱パッドまたは下に加熱ランプに配置されているケージにマウスを置きます。
- 2週間で皮膚のステープルを削除します。
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Discussion
このプロトコルは、きれいにし、容易に糖尿病や正常マウスの腎臓被膜下に膵島または細胞を提供するための実用的かつ効率的なオプションが用意されています。腎被膜下に細胞を移植するために使用される最終的な配信のチューブ（PE50）に膵島または細胞を集中し、ペレット化の技術は、細胞、またはマウスへの過度のストレスを軽減しながら細胞を移植するのは簡単で効果的な方法を提供しています。
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Acknowledgments
UCSFの糖尿病センター。 NIH UCSF DERC膵島コア。 JDRF。 LIfeScan株式会社ジョンソン＆ジョンソン社。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
