Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging
Summary
Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.
Abstract
Die subventrikulären Zone (SVZ) ist einer der beiden neurogenen Zonen in der postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen mit astrozytären Funktionen (genannt SVZ Astrozyten), Neuroblasten und mittleren Vorläuferzellen. Neuroblasten in der SVZ geboren tangential migrieren eine große Entfernung zum Riechkolben, wo sie differenzieren sich in Interneuronen. Interzelluläre Signalisierung durch Adhäsionsmoleküle und diffusionsfähigen Signale spielen wichtige Rollen bei steuernden Neurogenese. Viele dieser Signale auslösen interzellulären Kalzium-Aktivität, die Informationen innerhalb und zwischen Zellen überträgt. Calcium-Aktivität ist deshalb reflektierenden der Aktivität von extrazellulären Signalen und ist eine optimale Möglichkeit, funktionelle interzellulären Signalisierung zwischen SVZ Zellen zu verstehen.
Calcium-Aktivität wurde in vielen anderen Regionen und Zelltypen, einschließlich reife Astrozyten und Neuronen untersucht worden. Allerdings ist die traditionelle Methode, um load-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff (dh Badbelastung) war nicht beim Laden alle SVZ Zelltypen effizient. Tatsächlich schließt die Zelldichte in der SVZ Farbstoffdiffusion innerhalb des Gewebes. Darüber hinaus wird die Vorbereitung sagittalen Schnitten bessere Erhaltung der dreidimensionalen Anordnung SVZ Zellen, insbesondere der Strom der Neuroblast Migration auf dem rostralen-kaudalen Achse.
Hier beschreiben wir Methoden, um Sagittalschnitten mit der SVZ, die Belastung der SVZ-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff und den Erwerb von Kalzium Aktivität mit Zeitraffer-Filme erstellen. Wir verwendeten Fluo-4 AM Farbstoff zum Laden SVZ Astrozyten unter Druck Anwendung innerhalb des Gewebes. Calcium-Aktivität wurde mit einem konfokalen Mikroskop ermöglicht eine genaue Auflösung zur Unterscheidung von einzelnen Zellen. Unser Ansatz ist auf andere Zonen einschließlich neurogener der erwachsenen hippocampalen subgranularen Zone und embryonalen neurogenen Zonen. Darüber hinaus können andere Arten von Farbstoffenunter Verwendung des beschriebenen Verfahrens werden.
Protocol
Discussion
Calcium Bildgebung SVZ Zellen verwendet wurde, um Muster in spontaner Aktivität in Neuroblasten 10, Rezeptorkanals Expression in beiden Neuroblasten und Astrozyten und 4,6,8 astrozytären Calciumwellen 3 studieren. Da Zellen in der SVZ entweder unreif sind oder glialen Eigenschaften, sie nicht feuern Aktionspotentiale 11,12, was bedeutet, dass Millisekunde Veränderungen in Spannungspotential indikativ Aktivität in reifen Netzen nicht anwendbar ist in dieser Region. Daher er…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell Zuschuss (AB), Pardee Stiftung (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) und einer NSF Graduate Research unterstützt Fellowship (BL). Wir danken den Bordey lab Mitglieder für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Das vorliegende Material ist auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, Incorporated das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovationen.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
Referências
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