Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging
Summary
En metode for å laste subventricular sone (SVZ) celler med kalsium indikator fargestoffer for opptak kalsium aktivitet er beskrevet. Postnatal SVZ inneholder tett pakket celler, inkludert nevrale stamceller og neuroblasts. Snarere enn å bruke bad lasting injisert vi fargestoff ved trykk inne i vevet lar bedre fargestoff diffusjon.
Abstract
Subventricular sone (SVZ) er en av de to soner i nevrogene postnatal hjernen. Den SVZ inneholder tettpakkede celler, inkludert nevrale stamceller med astrocytic funksjoner (kalt SVZ astrocytes), neuroblasts og mellomliggende progenitorceller. Neuroblasts født i SVZ tangentialt migrere en stor avstand til luktelappen, hvor de differensieres til interneurons. Intercellulære signalering gjennom adhesjonsmolekyler og diffusjonsevne signaler spiller viktige roller i kontrollerende neurogenesis. Mange av disse signalene utløse intercellulære kalsium aktivitet som overfører informasjon i og mellom cellene. Kalsium aktivitet er således reflektert av aktiviteten av ekstracellulære signaler og er en optimal måte å forstå funksjonell intercellulære signalering blant SVZ celler.
Kalsium aktivitet er undersøkt i mange andre regioner og celletyper, inkludert modne astrocytes og nevroner. Men den tradisjonelle metoden for å load celler med kalsium indikator dye (dvs. bad lasting) var ikke effektiv ved lasting alle SVZ celletyper. Faktisk, utelukker cellulære tetthet i SVZ fargestoff diffusjon inne i vevet. I tillegg vil forberede sagittale stykker bedre bevare tredimensjonale arrangement av SVZ celler, spesielt strømmen av neuroblast migrasjon på rostral-kaudal aksen.
Her beskriver vi metoder for å forberede sagittale seksjoner som inneholder SVZ, lasting av SVZ celler med kalsium indikator fargestoff, og oppkjøpet av kalsium aktivitet med time-lapse filmer. Vi brukte Fluo-4 AM dye for lasting SVZ astrocytes med spyling inne i vevet. Kalsium aktivitet ble registrert med en scanning confocal mikroskop slik at en presis oppløsning for å skille de forskjellige cellene. Vår tilnærming er gjeldende for andre nevrogene soner inkludert voksen hippocampus subgranular sone og embryonale nevrogene soner. I tillegg andre typer fargestoffer kanpåføres ved hjelp av den beskrevne metode.
Protocol
Discussion
Kalsium avbildning av SVZ celler har blitt brukt til å studere mønstre i spontan aktivitet i neuroblasts 10, reseptor kanal uttrykk i både neuroblasts og astrocytes 4,6,8 og astrocytic kalsium bølger 3. Siden cellene i SVZ er enten umoden eller har glial egenskaper, har de ikke brann aksjonspotensialer 11,12, noe som betyr at millisekund endringer i spenningspotensial tyder på aktivitet i modne nettverk er ikke aktuelt i denne regionen. Derfor fange tregere kalsium hendel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell stipend (AB), Pardee fundament (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), og en NSF Graduate Research Fellowship (BL). Vi takker Bordey lab medlemmer for nyttige kommentarer på manuskriptet. Det foreliggende materiale er basert på arbeid delvis støttet av staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Innholdet er utelukkende ansvaret av forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn i staten Connecticut, Department of Public Health i delstaten Connecticut eller CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
