Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio
Summary
Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l'attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all'interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.
Abstract
Zona subventricolare (SVZ) è una delle due zone neurogenici nel cervello postnatale. La SVZ contiene cellule densamente, comprese le cellule progenitrici neurali con caratteristiche astrocitari (chiamati astrociti SVZ), neuroblasti, e cellule progenitrici intermedi. Neuroblasti nati nel SVZ tangenzialmente la migrazione di una grande distanza al bulbo olfattivo, dove si differenziano in interneuroni. Segnalazione intercellulari attraverso molecole di adesione e segnali diffusibili svolgono un ruolo importante nel controllo della neurogenesi. Molti di questi segnali innescare l'attività intracellulare di calcio che trasmette informazioni all'interno e tra le cellule. Attività calcio è così riflettente dell'attività di segnali extracellulari ed è un modo ottimale per comprendere funzionale segnalazione intercellulare tra cellule SVZ.
L'attività di calcio è stato studiato in molte altre regioni e tipi di cellule, tra cui gli astrociti e neuroni maturi. Tuttavia, il metodo tradizionale di loacellule d con indicatore colorante calcio (carico bagno ad esempio) non era efficiente al caricamento di tutti i tipi di cellule SVZ. Infatti, la densità cellulare nel SVZ osta diffusione colorante all'interno del tessuto. Inoltre, si preparano sezioni sagittali di preservare la disposizione tridimensionale delle cellule SVZ, in particolare il flusso di migrazione neuroblast sul rostrale-caudale asse.
Qui, descriviamo i metodi per preparare sezioni sagittali contenenti la SVZ, il caricamento delle cellule SVZ con colorante indicatore di calcio, e l'acquisizione delle attività di calcio con filmati time-lapse. Abbiamo usato Fluo-04:00 colorante per il caricamento di astrociti SVZ con applicazione di una pressione all'interno del tessuto. L'attività di calcio è stato registrato utilizzando un microscopio a scansione confocale che permette una risoluzione precisa per distinguere le singole celle. Il nostro approccio è applicabile ad altre zone neurogenici compresa la zona dell'ippocampo adulto subgranular embrionali e zone neurogena. Inoltre, altri tipi di coloranti possonoessere applicato utilizzando il metodo descritto.
Protocol
Discussion
Immagini di calcio delle cellule SVZ è stato utilizzato per studiare gli schemi di attività spontanea in neuroblasti 10, canale di espressione del recettore in entrambi i neuroblasti e astrociti 4,6,8 e onde di calcio astrocitari 3. Poiché le cellule del SVZ o sono immaturi o hanno proprietà gliali, non sparare potenziali di azione 11,12, il che significa che i cambiamenti millisecondo potenziale tensione indicativa di attività in reti maturi non è applicabile in questa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (DC007681, AB), CT cellule staminali di assegnazione (AB), Pardee fondazione (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein Nazionale Research Service Awards (NRSA) (SZY), e un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Ringraziamo i membri del laboratorio Bordey per gli utili commenti sul manoscritto. Il materiale presente è basata su un lavoro in parte sostenuto da parte dello Stato del Connecticut sotto la ricerca sulle cellule staminali Connecticut programma di sovvenzioni. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dello Stato del Connecticut, del Dipartimento di Sanità Pubblica dello Stato del Connecticut o TC Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
