نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل<em> OVO السابقين</em> Electroporation
Summary
وصفت وهناك طريقة لنقل الجينات إلى أجنة الدجاج في مراحل الحضانة في وقت لاحق (أقدم من هامبورغ وهاملتون مرحلة (سمو) 22). هذا الأسلوب يتغلب على عيوب<em> في البيضة</emتطبق> electroporation إلى أجنة الدجاج وأقدم هو تقنية مفيدة لدراسة وظيفة الجين والتنظيم في مراحل أقدم التنموية.
Abstract
الجنين الدجاج ويوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة الجين والتنظيم أثناء التطور الجنيني. في electroporation OVO هو وسيلة قوية لالافراط في التعبير عن الجينات الخارجية أو أسفل تنظيم الجينات الذاتية في الجسم الحي في أجنة الدجاج 1. ويمكن هياكل مختلفة مثل جينات الحمض النووي الترميز البلازميدات 2-4، صغيرة تدخل الحمض النووي الريبي (سيرنا) البلازميدات 5، صغيرة الاصطناعية RNA oligos 6، و [أليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير 7 transfected بسهولة في أجنة الدجاج بواسطة electroporation. ومع ذلك، يقتصر تطبيق في electroporation البيضة إلى الأجنة في مراحل الحضانة في وقت مبكر (الذين تقل أعمارهم عن مرحلة HH20 – وفقا لهامبورغ وهاملتون) 8، وهناك بعض المساوئ لتطبيقه في الأجنة في مراحل لاحقة (أقدم من مرحلة HH22 – ما يقرب من 3.5 أيام التنمية). على سبيل المثال، الغشاء المحي في مراحل لاحقة هو أوسوحليف تمسك الغشاء يجب وفتح نافذة في وعاء يسبب تمزق في الأوعية، مما أدى إلى وفاة الأجنة، وتغطي أقدم الأجنة بواسطة السفن المحي والسقاء، حيث أنه من الصعب الوصول إليها والتلاعب في الأجنة، أقدم أجنة تحرك بقوة ويصعب السيطرة على التوجه من خلال نافذة صغيرة نسبيا في وعاء.
في هذا البروتوكول نظهر سابق الأسلوب electroporation OVO لنقل الجينات في أجنة الدجاج في المراحل المتأخرة (أقدم من مرحلة HH22). لelectroporation OVO السابقين، تستزرع الأجنة في أطباق بتري (9) وتنتشر على نطاق واسع المحي والأوعية السقاء. في ظل هذه الظروف، يتم الوصول إليها بسهولة الأجنة أقدم الدجاج والتلاعب بها. ولذلك، هذا الأسلوب يتغلب على عيوب في electroporation OVO تطبيقها على الأجنة أقدم الدجاج. باستخدام هذه الطريقة، يمكن البلازميدات transfected بسهولة إلى أجزاء مختلفةمن أجنة الدجاج أقدم 10-12.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول يوفر دليلا لنقل الجينات إلى أجنة أقدم الدجاج (على سبيل المثال، في السقف البصري في E6) بواسطة electroporation OVO السابقين. وتمتد هذه الطريقة على استخدام electroporation إلى أجنة الدجاج وكبار السن ويمكن تطبيقها بسهولة على العديد من المختبرات لدراسة وظيفة الجينات <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG؛ LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
