Transfert de gènes dans des embryons de poulet âgés par<em> Ex ovo</em> Électroporation
Summary
Une méthode de transfert de gènes dans des embryons de poulet à des stades d'incubation plus tard (plus de Hamburger et Hamilton étape (HH) 22) est décrite. Cette méthode permet de surmonter les inconvénients de<em> In ovo</emÉlectroporation> appliqué à des embryons de poulet âgés et est une technique utile pour étudier la fonction des gènes et de la réglementation à un âge stades de développement.
Abstract
L'embryon de poulet fournit un excellent modèle pour étudier la fonction des gènes et de la réglementation au cours du développement embryonnaire. En électroporation in ovo est une méthode puissante pour surexprimer des gènes exogènes ou vers le bas-réguler les gènes endogènes in vivo dans les embryons de poulet 1. Différentes structures telles que les plasmides ADN codant pour les gènes 2-4, petits ARN interférents (siARN) plasmides 5, petite ARN synthétique oligos 6, et morpholino oligonucléotides antisens 7 peut être facilement transfecté dans des embryons de poulet par électroporation. Toutefois, l'application d 'électroporation in ovo est limitée aux embryons à des stades d'incubation au début (plus jeune que le stade HH20 – selon Hambourg et Hamilton) et 8 il ya quelques inconvénients pour son application dans les embryons à des stades ultérieurs (plus que le stade HH22 – environ 3,5 jours de développement). Par exemple, la membrane vitelline à un stade ultérieur est généraleallié collé à la membrane doit et d'ouvrir une fenêtre dans la coquille provoque la rupture des vaisseaux, entraînant la mort des embryons; âgés embryons sont couverts par vaisseaux vitellins et allantoïdien, où il est difficile d'accès et de manipuler les embryons; âgés embryons déplacer vigoureusement et il est difficile de contrôler l'orientation à travers une fenêtre relativement faible dans la coquille.
Dans ce protocole, nous démontrons une méthode d'électroporation in ovo ex de transfert de gènes dans des embryons de poulet à des stades tardifs (plus que le stade HH22). Pour l'électroporation in ovo ex, les embryons sont cultivés dans des boîtes de Pétri de 9 et de la vitelline et les vaisseaux allantoïde sont largement répandues. Dans ces conditions, les embryons de poulet âgés sont facilement accessibles et manipulables. Par conséquent, cette méthode permet de surmonter les inconvénients de l'électroporation in ovo dans appliqués aux embryons de poulet âgés. En utilisant cette méthode, des plasmides peuvent être facilement transfecté dans les différentes partiesdes embryons de poulet âgés 10-12.
Protocol
Discussion
Ce protocole fournit un guide pour le transfert de gènes dans des embryons de poulet âgés (par exemple, dans le toit optique à E6) par électroporation in ovo ex. Cette méthode étend l'utilisation de l'électroporation à des embryons de poulet âgés et peut être facilement appliquée à de nombreux laboratoires pour étudier la fonction des gènes in vivo à des stades ultérieurs. Les embryons de E4 à au moins E7 peut être avec succès par électroporation par ce procédé et les em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la recherche allemande (DFG; LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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