Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica
Summary
Considerando campionamento saliva per il futuro l'applicazione clinica, un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) la sonda è stato fabbricato per adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi diretta di saliva non digerito da nanoLC LTQ-spettrometria di massa ha dimostrato la capacità di sonde LLUF per rimuovere le proteine di grandi dimensioni e di proteine ad alta abbondanza, e rendere a basso abbondanti peptidi più rilevabile.
Abstract
Anche se saliva proteoma umano e peptidoma sono stati rivelati 1-2 sono stati identificati da majorly digerisce trittico di proteine salivari. Identificazione di peptidoma indigeno di saliva umana senza preventiva digestione con enzimi esogeni diventa imperativo, in quanto i peptidi nativi nella saliva umana fornire i valori possibili per la diagnosi della malattia, prevedere la progressione della malattia, e monitorare l'efficacia terapeutica. Di un campione adeguato è un passo fondamentale per la valorizzazione di identificazione delle risorse umane peptidoma saliva indigena. I metodi tradizionali di campionamento saliva umana che coinvolge la centrifugazione per rimuovere i detriti 3-4 potrebbe essere troppo tempo per essere applicabile per uso clinico. Inoltre, la rimozione dei detriti mediante centrifugazione può essere in grado di pulire la maggior parte dei patogeni infetti e rimuovere le proteine molto abbondante, che spesso ostacolano l'individuazione di peptidoma scarsa abbondanza.
Convenzionali approcci proteomici che pripalmente utilizzano bidimensionale elettroforesi su gel (2-DE) gel in coniugazione con in-gel digestione sono in grado di identificare molte proteine saliva 5-6. Tuttavia, questo approccio non è in genere sufficientemente sensibile per rilevare peptidi / proteine poco abbondanti. Liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) proteomica base è una alternativa che può identificare proteine senza preventiva 2-DE separazione. Sebbene questo approccio fornisce una maggiore sensibilità, deve generalmente campione prima pre-frazionamento 7 e pre-digestione con tripsina, che rende difficile per l'uso clinico.
Per aggirare l'ostacolo in spettrometria di massa dovuta alla preparazione del campione, abbiamo sviluppato una tecnica chiamata ultrafiltrazione capillare (CUF) sonde 8-11. I dati del nostro laboratorio hanno dimostrato che le sonde CUF sono in grado di catturare proteine in vivo da diversi microambienti in animali in modo dinamico e minimamente invasiva 8 –11. N centrifugazione è necessario in quanto una pressione negativa viene creata semplicemente siringa ritiro durante il prelievo. Le sonde CUF combinati con LC-MS sono riusciti a identificare le proteine trittico-digerite 8-11. In questo studio, abbiamo aggiornato la tecnica di campionamento ultrafiltrazione con la creazione di un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) sonda che può facilmente adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi da LC-MS senza digestione con tripsina ha mostrato che la saliva umana indigenamente contiene molti frammenti peptidici derivati da varie proteine. Campionamento saliva con sonde LLUF evitato centrifugazione, ma rimosso in maniera efficace molte proteine abbondanza più grandi e più alta. I nostri risultati di spettrometria di massa ha evidenziato che molti peptidi poco abbondanti è diventato rilevabile dopo filtrare le proteine più grandi con sonde LLUF. Individuazione di peptidi a basso saliva abbondanza era indipendente multi-fase di separazione campione con cromatografia. Per l'applicazione clinica, le sonde LLUF incorporanod con LC-MS potrebbero essere utilizzati in futuro per monitorare la progressione della malattia da saliva.
Protocol
Discussion
Abbiamo scoperto che esistono molti frammenti peptidici in saliva umana non digerito. Questi frammenti peptidici sono derivati dalle varie forme di prolina ricchi di proteine, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, del recettore immunoglobuline polimerico, satherin, S100A9. Ci possono essere molti fattori che contribuiscono alla produzione di peptidi con siti di clivaggio indeterminato. Per esempio, alcuni frammenti peptidici possono essere naturalmente presenti in tu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Grants Salute (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 e R21-I58002-01). Ringraziamo C. Niemeyer per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
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