Summary
פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.
Abstract
העסקה הגדולה של התקדמות ביטוי גנים הבנה נעשה שימוש במערכות חוץ גופית. עבור רוב המחקרים, מבחני תפקודית מתבצעות באמצעות תמציות כי הם מוכנים בכמויות גדולות מ 10-50 או יותר ליטרים של התאים הגדלים ההשעיה. עם זאת, אלה בקנה מידה גדול ההכנות אינן ניתנות במהירות לבדיקת אפקטים חוץ גופית הנגרמות כתוצאה ממגוון רחב של טיפולים הסלולר או תנאים vivo. מאמר זה מציג את יומן הווידאו שיטה להכנת תפקודית בקנה מידה קטן תמציות גרעיני, באמצעות תאים הלה כדוגמה. שיטה זו מתבצעת באמצעות כמה כמו 3 150 מ"מ לוחות של תאים שגודלו כמו monolayers חסיד. כדי להמחיש את יעילות בקנה מידה קטן תמציות, אנו מראים כי הם פעילים כמו תמצית גרעיני בכמות גדולה עבור מצמידים RNA פולימראז II שעתוק / שחבור תגובות. כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול תמצית, אנו מראים כי שחבור הוא בוטל ב תמציות מוכנות מתא הלהשל מטופלים עם התרופה מעכב שחבור E7107. פרוטוקול בקנה מידה קטן צריך להיות רלוונטי, בדרך כלל, תהליך או סוג התא יכול להיחקר במבחנה באמצעות תמציות סלולריים. אלה כוללים את התאים החולים, כי הם זמינים רק בכמויות מוגבלות או תאים שנחשפו סוכנים רבים כגון תרופות, סוכני ה-DNA, פגיעה, או RNAi transfection, אשר דורשים את השימוש של אוכלוסיות תאים קטנים. בנוסף, כמויות קטנות של תאים בוגרים טריים נוחות ו / או נדרש עבור יישומים מסוימים.
Protocol
1. הלה התאים גוברת להפקת נשק גרעיני
- צלחת תאים הלה על שלוש צלחות 150 מ"מ עם DMEM התקשורת השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין / סטרפטומיצין. לגדול ב 37 ° C חממה עם CO 2 עד 5% תאים הם confluent 90%.
טיפ, פיצול תאים 1:10 מהצלחת היבול confluent ו -3 ימים לאחר פיצול.
עצה, צלחת נוספת ניתן לגדל במקרה שאין מספיק תאים עם שלוש צלחות (לדוגמה, אם התאים הם פחות מ 90% confluent).
2. הכן וצננו פתרונות תמצית גרעיני
- להכין פתרונות טריים כמתואר בטבלה 2.
- Aliquot 10 מ"ל של מאגר hypotonic לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל של מאגר מלח גבוהה 1 מ"ל של מאגר דלת מלח לתוך צינורות 1.5 מ"ל Eppendorf. לצנן את מאגרים על קרח. מוסיפים את כמויות מתאימות של PMSF ו DTT למאגר זה מיד לפני השימוש (ראה
3. איסוף תאים הלה להפקת גרעיני
- Aspirate מדיה מן התאים ולשטוף את התאים פעם אחת עם 13 מ"ל של בטמפרטורת החדר 1X PBS לכל צלחת.
- Aspirate לשטוף PBS.
עצה, לשאוב כמה שיותר PBS ככל האפשר על ידי aspirating 1, ולאחר מכן עומדת צלחת בצד שלה, מחכה כמה שניות, ו aspirating את השאר.
- באמצעות מרים התא, מגרדים תאים לקצה התחתון של הצלחות, ולאחר מכן להעביר את התאים צינור Eppendorf. להימנע בועות. 3 לוחות של תאים השרוטות צריך להתאים את צינור 1 1.5 Eppendorf מ"ל.
עצה, קל יותר להעריך את עוצמת הקול של תאים אם צינור Eppendorf משמש. על סולם, השתמש צינורות פלקון.
- סרכזת על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 5 דקות ב 100 XG כדי גלולה התאים.
4. יופי תאים הלה במאגר hypotonic
5. Lyse תאים באמצעות Homogenizer Dounce
- השתמש מאגר hypotonic לשטוף dounce ולאחר מכן לצנן אותו על קרח. נגב יבש העלי עם WIP משימה עדינהER (למשל Kimwipe). הסר חוצץ הנותר מן dounce באמצעות 1000 micropipette μl עצה המורחבת.
- העברת תאים נפוחות לתוך dounce. לאט לאט להזיז את העלי חזק של dounce למעלה ולמטה 5 פעמים כדי lyse התאים, להיות זהיר, כדי למנוע בועות.
- Assay עבור תמוגה התא באמצעות aliquot 5 μl של תאים dounce. מניחים את aliquot בצינור Eppendorf ומוסיפים נפח שווה של Trypan כחול. מכניסים את התערובת על שקף ולבדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. גרעינים של תאים lysed יופיע כחול. כ -90% תמוגה הוא אידיאלי.
עצה, מספר הפעמים התאים יש dounced ישתנה בהתאם אטימות של dounce. בעת ביצוע בפרוטוקול זה בפעם הראשונה, לקבוע את מספר פעמים כדי dounce ידי ביצוע צעד 5.3 לאחר שבץ כל אחד עם dounce. לא יתר על המידה dounce, douncing מוגזמת תהרוס גרעינים.
- להעביר את התאים lysed כדי מראש Chilleד Eppendorf הצינור ספין 4 ° C microfuge 5 דקות ב 1500 x גרם. גלולה המכילה את הגרעינים. בזהירות להעביר supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את הגרעינים. Supernatant מכיל את הציטופלסמה.
עצה, הציטופלסמה יכול לשמש הוא או עיבוד נוסף כדי S100 באמצעות ספין אותו במהירות גבוהה המשמש תמציות בתפזורת (ראה 1 להכנת S100 פעיל מ תמציות בתפזורת).
6. מלח חלץ את גרעיני
- לאמוד את היקף גרעיני ארוז (PNV) על ידי הסתכלות על הדרגתיות על הצינור. PCV של μl 500 בדרך כלל מניבה PNV של μl 400.
- הוסף ½ X PNV של מאגר מלח נמוכה כדי גרעינים ידי הוספת טיפ micropipette לחלק התחתון של הצינור ולאט לאט גמירה לתוך מאגר גרעיני תוך ערבוב בעדינות. לא pipet מעלה ומטה. קפיצי בעדינות את הצינורות על מנת לוודא כי היא גלולה resuspended לחלוטין לפני המשך הצפת דלת מלח. <li> הוסף ½ X PNV של מאגר מלח גבוהה ובמהירות לערבב 1 זמן על ידי צינור היפוך. לא לרעוד. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
עצה לעתיד עדין עם גרעינים כאשר הם מאגר מלח גבוהה, כדי למנוע lysing אותם.
- ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 15 דקות על 18,000 X גרם. Supernatant הוא תמצית מלח גבוהה גרעינית (HS-NE). שלוש צלחות של תאים בדרך כלל תשואה 500-600 μl של HS-NE.
7. להתרכז Dialyze תמצית גרעיני
- העברת 500 μl של HS-NE לתוך צונן מיני centricons (Amicon) ו - 50 דקות ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge על 14,000 X גרם. מרחב מיני centricon (Amicon) ולמקם אותו צינור Eppendorf חדש. ספין דקות 2 ב 4 ° C 1000 XG להתאושש HS-NE. HS-NE יהיה מרוכז כדי μl כ 115.
- שימוש Pipetman P200, להעביר 45 aliquots μl של HS-NE לתוך מיני דיאליזה Slide-A-Lyzers, ומניחים אותם 500 מ"ל של מאגר דיאליזה צונן. ודא התחתון של Slide-A-Lyzer מיושר עם החלק התחתון של מצוף. מערבבים במשך 1-2 שעות ב 4 ° C. NE יופיעו מעונן אחרי דיאליזה.
עצה, האם לא צנטריפוגות כדי להסיר משקע עכור הוא ציין כי לאחר דיאליזה, כמו צנטריפוגה זה מפחית את הפעילות של מיצוי.
- NE ניתן להשתמש מיד או aliquoted. Aliquots יש פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. NE ניתן לאחסן לעבור לפחות שני מחזורי ההפשרה ההקפאה, מבלי לאבד את הפעילות.
8. נציג תוצאות
לאחרונה, יעילה במערכות חוץ גופית עבור צימוד שעתוק RNAP השני שחבור פותחו 2-5. מערכות אלו מועסקים תאים הלה גדל בכמויות גדולות ולכן הם לא מקובל במהירות לבחון את ההשפעות של טיפולים תאיים ספציפיים על דוגמאות רבות. על בסיס זה צריךND השירות הכללי של פרוטוקול בקנה מידה קטן תמצית (ראו דיון), הקמנו שיטה חזקה בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. נציג נתונים המשווים II RNAP שעתוק / שחבור התגובה בתמצית בקנה מידה קטן גרעינית עם תמצית גרעיני בתפזורת מוצג באיור 2. CMV-DNA מבנה, המכיל מקדם CMV ו encodes המצע שחבור רגיל (FTZ 3, איור 2 א) שימש לניתוח. כאשר מבנה הודגר בכמויות גדולות (1-3 נתיבים) או בקנה מידה קטן (4-6 נתיבים) תמצית, רמות דומות של המתהווה מראש mRNA היו מסונתז על ידי נקודה 5 דקות זמן (איור 2, מסלולים 1 ו -4 ). בעקבות תוספת של α-amanitin לחסום שעתוק נוסף, את ביניים שחבור ומוצרים החתוכות שנצבר לאורך זמן עם קינטיקה דומה בשני סוגי תמציות (איור 2, נתיבי 2, 3, 5, 6). תוצאות אלו מייצגות מראים את היעילות של ההפיכה LED RNAP II שעתוק / שחבור מערכת דומה תמציות גרעיני בתפזורת ואת בקנה מידה קטן.
כדי להדגים את התועלת של השיטה בקנה מידה קטן תמצית, תמציות הוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור, E7107, או שליטה שלילית מתחם pladienolide F 6,7 ואז RNAP מצמידים II שעתוק / שחבור assay בוצע. כפי שניתן לראות באיור 3, שעתוק על ידי RNAP השנייה התרחשה ביעילות תמציות שהוכנו F הן Pladienolide ו E7107 תאים שטופלו (10 נקודות זמן דקות). לעומת זאת, שחבור התרחשו בדרך כלל תמצית מוכנה מ-F-שטופלו בתאים Pladienolide אך בוטל ב E7107 שטופלו בתאים (איור 3, 20-60 דקות נקודות זמן). נתונים אלה מספקים הוכחה של מושג על שימוש בקנה מידה קטן תמציות גרעיני לטיפול מיוחד של תאים בקנה מידה קטן.
jpg "/>
באיור 1. סכמטי של פרוטוקול בקנה מידה קטן חלץ. שלב P1. התאים גדלים כמו monolayers, קוצרים הצלחות באמצעות מרים תא נפוחות על ידי תוספת של מאגר hypotonic. שלב P2. תאים lysed באמצעות homogenizer Dounce ו centrifuged כדי גלולה גרעינים. שלב P3. גרעינים מופרדים בציטופלסמה ועוברים תעשיית מלח. שלב P4. תמצית גרעיני מרוכזת ו dialyzed. שלב P5. תוצאות מתקבלים המראים כי תמציות גרעיני תפקודית (ראה איור 2 מפורטת יותר).
איור 2. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הם חזקים ב assay RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה. א סכמטי של תבנית CMV-FTZ דנ"א המשמש מצמידים RNAP II שעתוק / שחבור. האמרגן CMV ואת הגדלים של אקסונים ו אינטרון מצוינים. ב השוואת מצמידים RNAPהשנייה שעתוק / שחבור assay שימוש או תמצית גרעיני בתפזורת או בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. α-amanitin נוסף לאחר 5 דקות של שעתוק שחבור הורשה להופיע על 30 ו - 60 דקות. RNA הופק ו מופרדים על ג'ל 5% polyacrylamide denaturing ו זוהה על ידי phosphoimager. ביניים של שחבור ומוצרים מצוינים. אנדוגני U6 snRNA ו tRNA להציג בתמצית, וכי הם 32 P-שכותרתו במהלך הדגירה מצוינים. ר '3 לפרוטוקול מפורט על מערכת RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה.
איור 3. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני שהוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור התרופה E7107 פגומים ב שחבור. תאים טופלו Pladienolide מיקרומטר 3 F או E7107 כמותיאר 6 ולאחר מכן להשתמש כדי להכין בקנה מידה קטן תמציות גרעיני. במהלך הזמן בוצע באמצעות assay אותו שעתוק / שחבור כמו באיור 2. ביניים של שחבור ומוצרים, ואת U6 snRNA ו tRNA מצוינים.
Discussion
הקמנו שיטה מהירה לשחזור להכנת תמציות גרעיני של כמויות קטנות של תאים הלה גדל כמו monolayers. הראינו כי תמציות אלה הם חזקים ידי מראה כי קינטיקה והיעילות של RNAP השנייה שעתוק / שחבור מבחני דומים תמציות גרעיני בקנה מידה קטן ולא בתפזורת. הראינו את התועלת של תמציות על ידי הוכחת כי תמציות שהוכנו מתאי שטופלו בתרופה מעכב פעילות של שחבור שעתוק אבל פגום שחבור.
השיטה שלנו להכנת בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הוקמה על ידי שילוב וייעול שיטות שנקבעו בעבר להכנת תמציות מתאי הלה הגדלים להשעיה בקנה מידה גדול 1,8 ואת שיטת הכנה בקנה מידה קטן של תמציות 9. הקמנו פרוטוקול שלנו, כי את הקודמות בקנה מידה קטן תמציות לא פונקציונלי מבחני מסוימים, כגון שעתוק יחד / splicing assay. הבדל חשוב בין הקודמת בקנה מידה קטן פרוטוקול 9 ושלנו היא שאנחנו מותאם התנאים lysing תאים באמצעות dounce מיני ואילו בפרוטוקול הקודם lysed תאים על ידי לחיצה עליהם באמצעות מחט קטנה בקוטר 9. את המחט, תמוגה תוצאות בועות, מה שיכול להסביר מדוע תמציות היו פעילים ו / או קשה לשחזר את מבחני מסוימים. כמו כן הוסיף צעד ריכוז לפרוטוקול שלנו. צעד זה מגדיל את הפעילות של תמציות, אשר רגישים במיוחד הריכוז, וגם מגביל את השונות בין תמציות שהוא חלק קטן בקנה מידה ההכנות. לבסוף, ההכנה שלנו מתבצעת באופן שגרתי עם רק שלוש צלחות 150 מ"מ של תאים monolayer, ללא כל השפעה משמעותית על הפעילות לעומת תמציות בתפזורת. לפיכך, הנוהל אינו מקובל בקלות על בקנה מידה קטן ההכנות הדורשים ריאגנטים יקרים או מקום פנוי בתא מוגבלת. לדוגמה, הכנו SMALL בקנה מידה תמציות מתאי RNAi מציאה ומ לימפוציטית כרונית (CLL) בתאי לוקמיה החולה, שימוש בתמציות אלה מבחני תפקודית ו / או ביוכימי (EGF, JLH, טאי ו RR, לא פורסם). מצאנו כי תמציות הם בעלי ערך עבור RNAi ואחריו מבחני ביוכימיים ספציפיים, כגון immunopreciptations, מערבון, וכן צביעה כסף. לאחר הקמת היעילות של דריסה חלבון מסוים, מחקר מפורט יותר ניתן לבצע על ידי ביצוע מציאה יציבה התא קו, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להכין תמציות נוספות בעלות נמוכה יותר. ספקטרומטריית מסה של חלבונים הנמצאים immunoprecipitates לקבל את שורות תאים מציאה יהיה גם יישום שימושי של השיטה. בנוסף assay שעתוק / שחבור יחד כי היינו כדוגמה לתיאור הפרוטוקול שלנו כאן, בקנה מידה קטן תמציות צריך להיות רלוונטי בדרך כלל מבחני פונקציונלי ביוכימיים רבים, כגון אלו המשמשים רחוב אחרEPS של ביטוי גנים (למשל מכסת, שחבור שעתוק, polyadenylation, עיבוד microRNA). פרוטוקול יכול גם להיות מותאם עבור סוגי תאים חולים, כי ניתן להשיג גם ב ההשעיה (כגון תאים CLL) או גדל בתרבות (כגון fibroblasts המטופל). לבסוף, חלק cytoplasmic לקבל במהלך ההליך צריך להיות שימושי עבור מבחני גם פונקציונלית ביוכימי הדורשים הציטופלסמה.
Disclosures
הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Abcam, Plc.
Acknowledgments
אנו מודים Winkelbauer מ-הארט, א איברהים, פ ולנסיה, ק Dufu, ה 'נג לדיונים מועילים. תאים הלה התקבלו התרבות הלאומית Cell מרכז (מיניאפוליס, מינסוטה). כמו כן, אנו מודים Eisai Co, Ltd למתן E7107 ו דימות Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד לעזרה עם מיקרוסקופ אור. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM043375 כדי RR ו EGF ו NRSA העמיתים JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
