Un protocole simple pour extraire l'hémocytes de chenilles sauvages
Summary
Hémocytes d'insectes effectuer de nombreuses fonctions importantes, tant immunitaires et non immunitaires, à tous les stades de développement des insectes. Notre connaissance actuelle des types hémocytaires et de la fonction provient d'études sur les insectes des modèles génétiques. Ici, nous présentons une méthode pour l'extraction, la quantification et la visualisation des hémocytes des chenilles sauvages.
Abstract
Hémocytes d'insectes (l'équivalent de mammifères globules blancs) jouent un rôle important dans plusieurs processus physiologiques tout au long du cycle de vie d'un insecte 1. Dans les stades larvaires des insectes appartenant aux ordres des lépidoptères (papillons) et des diptères (mouches vraies), les hémocytes sont formés à partir de la glande lymphatique (un organe spécialisé hématopoïétique) ou des cellules embryonnaires et peuvent être transportés jusqu'au stade adulte. Hémocytes embryonnaires sont impliqués dans la migration cellulaire au cours de règlement sur le développement et la chimiotaxie cours de l'inflammation. Ils participent également à l'apoptose des cellules et sont essentiels pour l'embryogenèse 2. Hémocytes arbitrer le bras cellulaire de la réponse immunitaire innée des insectes qui comprend plusieurs fonctions, telles que l'agrégation cellulaire cellule propagation,, formation de nodules, la phagocytose et l'encapsulation des envahisseurs étrangers 3. Ils sont également responsables de l'orchestration spécifiques insectes défenses humorales cours de l'infection, comme le production de peptides antimicrobiens et d'autres molécules effectrices 4, 5. La morphologie et la fonction hémocytes ont été principalement étudiés dans génétiques ou physiologiques modèles d'insectes, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster 6, 7, les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae 8, 9 et le sphinx du tabac, Manduca sexta 10, 11. Cependant, peu d'informations existent actuellement sur la diversité, la classification, la morphologie et la fonction des hémocytes en espèces d'insectes non du modèle, en particulier celles recueillies auprès de 12 sauvage.
Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour extraire les hémocytes des chenilles sauvages. Nous utilisons l'avant-dernier stade Lithacodes fasciola (papillon jaune lingot d'épaules) (figure 1) et Euclea delphinii (aiguillat chêne limace) chenilles (Lepidoptera: Limacodidae) et montrent que des volumes suffisants de l'hémolymphe (sang des insectes)On peut isoler et nombres comptés à partir de larves hémocytaires individu. Cette méthode peut être utilisée pour étudier efficacement types hémocytaires chez ces espèces, ainsi que dans d'autres chenilles de lépidoptères liées récoltées sur le terrain, ou il peut être facilement combiné avec des dosages immunologiques conçus pour étudier la fonction des hémocytes suite à une infection microbienne ou avec des organismes parasitaires 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Méthodes d'extraction hémocytes d'insectes d'importance médicale et les insectes lépidoptères modèle ont déjà été signalés 9, 14. Méthodes d'extraction hémocytaires sont adaptées en fonction des espèces d'insectes, le stade de développement de l'insecte et de ses caractéristiques morphologiques. Par exemple, l'isolement hémolymphe de larves de Manduca peut être facilement réalisée en coupant la corne recourbée près de l'extrémité de l'abdom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS a été pris en charge par la bourse Harlan Trust (GWU) au cours de cette étude. Le financement de collecte sur le terrain et de reproduction L. fasciola et E. delphinii a été fourni par NSF grant DEB 0642438 à JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
Referências
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