Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen
Summary
Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.
Abstract
Insect hemocyten (gelijk aan zoogdieren witte bloedcellen) spelen een belangrijke rol in diverse fysiologische processen in het leven van een insect cyclus 1. In larvale stadia van insecten behorend tot de orde van de Lepidoptera (motten en vlinders) en Diptera (ware vliegen), worden hemocyten gevormd uit de lymfeklier (een gespecialiseerde hematopoietische orgel) of embryonale cellen en kan worden uitgevoerd door middel van het volwassen stadium. Embryonale hemocyten zijn betrokken bij celmigratie gedurende de ontwikkeling en chemotaxis regelgeving tijdens de ontsteking. Zij nemen ook deel in cel apoptose en zijn essentieel voor embryogenese 2. Hemocyten bemiddelen de cellulaire arm van het insect aangeboren immuunrespons die verschillende functies, zoals celspreiding, cel aggregatie, vorming van nodules, fagocytose en inkapseling van indringers 3 omvat. Zij zijn ook verantwoordelijk voor het orkestreren specifieke humorale afweer insect tijdens infectie, zoals de productie van antimicrobiële peptiden en andere effectormoleculen 4, 5. Hemocyte morfologie en functie zijn voornamelijk bestudeerd in genetische of fysiologische insect modellen, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster 6, 7, de muggen Aedes aegypti pt Anopheles gambiae 8, 9 en de tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. Er is echter weinig informatie bestaat momenteel over de diversiteit, classificatie, morfologie en functie van hemocyten in niet-model insectensoorten, met name die uit het wild gehaald 12.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de extractie van hemocyten van wilde rupsen. We gebruiken voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (geel-schouders slug mot) (figuur 1) pt Euclea delphinii (spiny eiken slug) rupsen (Lepidoptera: Limacodidae) en laten zien dat er voldoende hoeveelheden hemolymfe (insect bloed)kan worden geïsoleerd en hemocyte aantal getelde van individuele larven. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt onderzoeken hemocyte types in deze soorten en in andere lepidoptera rupsen geoogst van het veld, of het kan eenvoudig worden gecombineerd met immunologische assays ontworpen hemocyte functie onderzoeken na infectie met bacteriën of parasitaire organismen 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Werkwijzen voor het extraheren van hemocyten medisch belangrijke lepidoptera insecten en insecten model eerder gemeld 9, 14. Hemocyte extractie zijn aangepast op basis van de insectensoorten, de ontwikkelingsfase van het insect en de morfologische kenmerken. Zo kan hemolymfe isolatie van Manduca larven gemakkelijk worden uitgevoerd door knippen de gebogen hoorn het einde van de buik 15. Omdat slug rupsen (Limacodidae) missen deze buik structuur, hebben we een aparte protocol voor hemolymfe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS werd gesteund door de Harlan Trust Fellowship (GWU) tijdens deze studie. Financiering voor veld verzamelen en kweken van L. Fasciola pt E. delphinii werd verstrekt door NSF subsidie DEB 0642438 naar JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
Referências
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis – still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
