Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi
Summary
Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l'estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.
Abstract
Emociti insetti (equivalente a mammiferi globuli bianchi) svolgono un ruolo importante in diversi processi fisiologici durante tutto il ciclo di vita di un insetto 1. Negli stadi larvali di insetti appartenenti agli ordini dei Lepidotteri (farfalle e falene) e Ditteri (mosche vere), emociti sono formate dalla ghiandola linfatica (un organo specializzato ematopoietiche) o cellule embrionali e possono essere trasportati fino alla fase adulta. Emociti embrionali sono coinvolti nella migrazione cellulare durante la regolazione dello sviluppo e chemiotassi durante l'infiammazione. Hanno anche prendere parte a apoptosi delle cellule e sono essenziali per embriogenesi 2. Emociti mediare il braccio cellulare dell'insetto risposta immunitaria innata che include diverse funzioni, come la cella di diffusione, aggregazione cellulare, formazione di noduli, la fagocitosi e l'incapsulamento di invasori stranieri 3. Essi sono anche responsabili per orchestrare specifiche difese insetto umorali durante l'infezione, come la produzione di peptidi antimicrobici e altre molecole effettrici 4, 5. Hemocyte morfologia e funzione sono principalmente stato studiato in modelli genetici insetti o fisiologico, compresa la mosca della frutta, Drosophila melanogaster 6, 7, le zanzare Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e il hornworm tabacco, Manduca sexta 10, 11. Tuttavia, esistono scarse informazioni attualmente circa la diversità, la classificazione, la morfologia e la funzione di emociti in non-modello di specie di insetti, in particolare quelli raccolti in natura 12.
Qui si descrive un protocollo semplice ed efficiente per l'estrazione di emociti da bruchi selvatici. Usiamo penultimo instar Lithacodes fasciola (giallo-spalle falena slug) (Figura 1) e Euclea delphinii (spinoso slug rovere) bruchi (Lepidoptera: Limacodidae) e mostrare che i volumi sufficienti di emolinfa (sangue degli insetti)può essere isolato e numeri hemocyte contati da larve individuale. Questo metodo può essere usato per studiare efficientemente tipi hemocyte in queste specie così come in altri bruchi di lepidotteri correlati raccolti dal campo, oppure può essere facilmente combinati con analisi immunologiche destinati a studiare la funzione hemocyte dopo infezione microbica o organismi parassitari 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodi per l'estrazione di emociti da insetti clinicamente importanti lepidotteri e insetti modello sono stati precedentemente segnalati 9, 14. Metodi di estrazione Hemocyte sono adattati a seconda delle specie di insetti, lo stadio di sviluppo dell'insetto e le sue caratteristiche morfologiche. Per esempio, l'isolamento emolinfa da larve Manduca può essere facilmente eseguita tagliandoli corno curvo vicino all'estremità dell'addome 15. Perché bruchi slug (Limacodida…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS è stato sostenuto dalla fiducia Harlan Fellowship (GWU) nel corso di questo studio. I finanziamenti per la raccolta sul campo e allevamento L. Fasciola e E. delphinii sono state fornite dal NSF concedere DEB 0642438 al JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
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